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骨缺损是骨科经常遇到的难题。目前主要的治疗方法，如自体骨移植、异体骨移植、异种骨移植、金属及人工合成材料替代治疗等，均不能完全满足临床的需要。骨组织工程技术的发展为骨缺损的治疗提供了新的思路，其过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞与支架材料复合后联合培养及细胞-支架材料复合体植入体内三个步骤。本实验即基于上述原理，研究大鼠脂肪间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸成骨的情况，探索组织工程化骨的理想构建方式。第一章大鼠脂肪间充质干细胞分离、培养及生物学特性的研究目的：研究大鼠脂肪间充质干细胞分离、培养的方法，并探讨其生物学特性，以期为组织工程提供理想的种子细胞。方法：以无菌技术切取大鼠腹股沟脂肪组织，加入Ⅰ型胶原酶消化，多次离心获取细胞，接种入含10％新生牛血清的DMEM培养基，进行原代培养；待细胞生长至80％-90％融合，1：2传代培养。倒置显微镜、Gimmsa染色、透射电镜观察细胞形态。细胞计数法测定第3代细胞的贴壁率。MTT法测定第3、5、10代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第5代细胞的表面抗原分子。结果：原代细胞接种2d后，呈三角形、多角形、短梭形等多种形态，4-5d逐渐呈成纤维细胞样长梭形外观，7-9d细胞集落相互融合超过90％，呈漩涡状，10-12d长满瓶底。大鼠脂肪间充质干细胞增殖迅速，能稳定传代10代以上。Gimmsa染色，细胞胞核呈紫色，胞浆呈粉红色。透射电镜观察，细胞较幼稚，胞核较大，胞浆内细胞器不发达。第3代细胞贴壁率表明，2h、6h、12h细胞贴壁率分别为：33％±2％、75％±1％、92％±2％，24h细胞几乎完全贴壁。生长曲线显示，第3、5、10代细胞增殖迅速，各代间无明显差异。流式细胞仪检测显示，第5代细胞表达间充质干细胞的表面抗原分子：95％的细胞表达CD29、96％的细胞表达CD44，仅5％的细胞表达造血干细胞表面抗原分子CD34。结论：自大鼠脂肪组织中分离出的细胞具有间充质干细胞的特征，可作为骨组织工程的种子细胞。第二章大鼠脂肪间充质干细胞的体外成骨诱导、分化目的：探讨大鼠脂肪间充质干细胞经体外诱导向成骨细胞分化的条件及能力，为进一步研究其体内成骨情况奠定基础。方法：以含有10％新生牛血清、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和维生素D3的高糖DEME作为成骨诱导培养基，诱导第3代大鼠脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜、Gimmsa染色、透射电镜观察成骨诱导后细胞形态变化。Gomori改良钙钴法行碱性磷酸酶染色；碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞内碱性磷酸酶含量。茜素红S、四环素荧光标记钙结节形成情况。RT-PCR检测骨钙素mRNA的表达。免疫组织化学染色、Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果：大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导后，细胞体积增大，呈短梭形、多角形；细胞呈集落样层叠生长。成骨诱导7d，Gimmsa染色，细胞胞核呈紫色，胞浆呈粉红色，胞浆颗粒增多；透射电镜观察，细胞体积明显增大，胞核增大，胞浆中细胞器发达，可见胞浆颗粒。成骨诱导7d，Gomori改良钙钴法碱性磷酸酶染色，胞浆内即可见浅棕色至棕黑色的颗粒；成骨诱导14d，大部分细胞染色呈阳性，阳性率为80％±2％。成骨诱导14d内，细胞内的碱性磷酸酶含量，随着培养时间的延长逐渐增高。成骨诱导21d，钙结节形成明显，茜素红S染色呈红色，四环素荧光标记呈金黄色。成骨诱导14d、21d，RT-PCR鉴定细胞骨钙素mRNA的表达，在280bp段有单一的目的条带。成骨诱导21d细胞的表达强度强于成骨诱导14d的细胞。成骨诱导7d，Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色，细胞胞浆呈棕黄色；Westernblotting检测发现，成骨诱导14d的细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达强度强于成骨诱导7d的细胞。结论：大鼠脂肪间充质干细胞经体外成骨诱导能向成骨细胞分化，具有成骨的能力。第三章大鼠脂肪间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸体内成骨的研究目的：研究大鼠脂肪间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸体内成骨的情况，以期建立大鼠脂肪间充质干细胞成骨的动物模型。方法：将第3代大鼠脂肪间充质干细胞接种于纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸构建体外细胞-支架材料复合体并进行成骨诱导，然后植入大鼠背部肌袋内4w、8w、12w，于不同时间点分别取材观察体内成骨情况。HE染色、扫描电镜观察大鼠脂肪间充质干细胞在纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸上的粘附及类骨质形成的情况。5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学染色了解细胞标记情况。结果：大鼠脂肪间充质干细胞能粘附在纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸支架材料的表面及孔洞内。细胞-支架材料复合体植入体内4w、8w、12w，见大量类骨质形成，并逐渐取代支架材料，周围未见明显免疫反应。5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学染色证实类骨质来源于植入的大鼠脂肪间充质干细胞。结论：纳米羟基磷灰石／胶原／L-聚乳酸是一种理想的支架材料，大鼠脂肪间充质干细胞具有体内成骨的能力。