目的：鼻腔给药系统以其吸收迅速、起效快、生物利用度高等特点成为了近年来研究较多的可实现脑靶向作用的给药途径之一。报道称药物经鼻腔给药后除直接透过血脑屏障外,还可绕过血脑屏障直接进入脑组织,提高药物的脑靶向性。同时,纳米制剂作为新型的靶向剂型在鼻腔给药方面的应用受到了越来越多的关注,其制剂分子小,生物利用度高,易透过血脑屏障进入脑组织,能够增强药效,降低毒性,为药物的体内药效学和代谢动力学赋予新的特色,因此,其在脑靶向性方面的应用具有很大的研究前景。综合上所述,本课题展开“环维黄杨星D纳米粒的制备与脑靶向性评价”,结合鼻腔给药和纳米制剂的双重优势,建立环维黄杨星D纳米粒的质量评价标准；制剂前期应用脑微透析技术建立脑局部药动的研究,探讨环维黄杨星D鼻腔给药在脑靶向性方面的优势。制剂后期对环维黄杨星D纳米粒脑靶向性进行系统全面的评价研究。方法：1、环维黄杨星D HPLC分析方法的建立环维黄杨星D (CVB-D)分子结构中不含有双键,采用紫外检测器直接测定属于末端吸收,其专属性差、灵敏度低。本研究利用其结构中含有仲氨基的特点,采用异氰酸苯酯衍生化的方法,柱前衍生化后采用HPLC-UV的方法测定,并考察色谱条件的专属性、标准曲线、精密度、准确度、稳定性等。2、环维黄杨星D HPLC-MS/MS分析方法的建立CVB-D属于脂溶性生物碱,微透析采样技术使用接近内环境的水性灌流液,因此,探针的回收率低,因此,本研究又建立了CVB-D HPLC-MS/MS分析方法,本方法具有高度的特异性,灵敏度高,又省去了衍生等操作带来的误差,因此,能够准确测定微透析样品中CVB-D浓度,提升数据的可靠性。研究同时考察了该色谱条件的专属性、标准曲线、精密度、准确度、稳定性、萃取回收率、基质效应等。3、微透析采样灌流液改性剂的应用及CVB-D反向微透析的采样方法建立微透析采样技术中的灌流液包括的人工脑脊液和林格氏液都是接近于人体内环境的水性灌流液,CVB-D在水中的溶解度为0.105mg/mL,溶解度低,因此探针的回收率也较低,本研究在前期的研究结果上(考察的灌流液改性剂有：乙醇、β-环糊精、丙三醇、二甲基亚砜),确定使用30%的乙醇作为灌流液改性剂。(详情见本课题组成员刘新国博士毕业论文)。4、大鼠经灌胃、鼻腔和尾静脉注射给予CVB-D后的整体和局部药动学比较大鼠经灌胃、鼻腔和尾静脉给于CVB-D后,联合微透析技术和LC-MS/MS分析方法,同时对大鼠血液和脑部进行微透析采样,比较其给药后脑和血液的药动学参数、口服绝对生物利用度、AUC脑/AUC血液、DTE%、DTP%等,探讨鼻腔给药与其他两种给药方式相比较是否存在有一定的脑靶向优势。5、CVB-D壳聚糖纳米粒的制备本研究采用修饰的离子交联法制备了载药壳聚糖纳米粒,以纳米粒的粒径、PDI(分散指数)以及包封率为考察指标,通过单因素考察法优化了CVB-D壳聚糖纳米粒的制备工艺,主要考察的因素包括有壳聚糖(CS)与多聚磷酸钠(TPP)的质量比、搅拌速度与时间、溶液pH值、CS浓度和CVB-D的浓度等。6、CVB-D纳米粒的脑靶向性评价大鼠经鼻腔给予CVB-D壳聚糖纳米粒(CS-NPs)、CVB-D溶液剂和尾静脉给药CVB-D CS-NPs后,分别在不同时间点腹主动脉取血,脱颈处死,进一步分离出嗅球、海马和剩余脑组织,不同脑区和血液分别经匀浆萃取处理后进样分析,分析药物在脑组织中的分布情况,比较其不同组织部位的局部药动学参数,如：MRT,AUC脑/AUC血液、Cmax、 Tmax、DTE%、DTP%等,并考察实验所制备的CVB-D CS-NPs是否具有脑靶向性,以期对CVB-D纳米粒的脑靶向机制进行探讨。成果：1、建立了环维黄杨星D HPLC的分析方法色谱条件如下,仪器：Agilent 1100；色谱柱：依利特C18(200×4.6,5um); Phenomenex C18保护住(4×2.0 mm)；流动相,甲醇：水=85：15；流速：1ml/min；柱温：室温；进样量：10uL；检测波长：240nm；理论塔板数按CVB-D计不低于3000。2、建立了环维黄杨星D HPLC-MS/MS的分析方法色谱条件HPLC-MS/MS:Agilent 1260和6460三重四级杆质谱仪；色谱柱：Agilent C18 (150×4.6,5um)；Phenomenex C18保护住(4×2.0 mm)；流动相：甲醇：水(0.1%甲酸和5mmol/L乙酸铵)=50：50；流速：1ml/min,接三通分流；柱温：40℃;进样量：5uL；质谱条件电喷雾离子(ESI)源与MassHunter B 05数据采集器；喷雾电压：3500v;雾化气压：45psi；加热毛细管温度：300℃;正离子方式检测,扫描方式为多重反应监测(MRM),用于定量的离子分别为环维黄杨星Dm/z403.4(母离子)→372.3(子离子)；多奈哌齐(内标)：m/z380.2(母离子)→243.1(子离子),扫描时间为0.5s;3、在前期的研究结果上(考察的灌流液改性剂有：乙醇、β-环糊精、丙三醇、二甲基亚砜),确定使用30%的乙醇作为灌流液改性剂,流速为1.0uL/min。4、采用微透析技术对大鼠血液和脑部同时进行采样,微透析样品经处理后测定,比较其给药后脑局部和血液的整体药动学参数,通过对AUC脑/AUC血液、DTE%、DTP%、口服绝对生物利用度等对比分析,结果证明鼻腔给药与其他两种给药方式相比较存在有一定的脑靶向优势。5、载药壳聚糖纳米粒完整的制备工艺条件为CS与TPP的质量比为2.5：1,CS浓度为1.8mg/ml,溶液pH调至5.0,搅拌速度为800rpm,时间0.5h,加入CVB-D的浓度为2. Omg/ml,得到包封率为62.82±2.59%,zeta电势为+33.9±1.7 mV,粒径在235.37±12.71nm范围内的CVB-D CS-NPs。6、通过对脑组织分布的研究发现,药物经鼻腔给药后绣球部位Cmax显著升高,Tmax缩短,并且嗅球、海马的药时曲线均出现双峰现象,推测第一峰(0.5h左右)可能是药物经嗅球通路到达脑部,并通过查阅相关文献推测第二峰(2或4h左右)可能是药物经三叉神经通路进入脑组织,同时结果证明本实验所制备CVB-D CS-NPs具有一定脑靶向性。结论：1、在既定的色谱条件下,CVB-D浓度与对应峰面积比值线性关系良好,专属性符合要求,样品7.2min左右出峰,分离度良好,可用于CVB-D的定量分析。2、在既定的色谱质谱条件下,CVB-D和内标多奈哌齐对应峰面积比值和CVB-D浓度呈良好的线性关系,专属性、日内日间精密度、稳定性、基质效应、样品萃取回收率等考察指标均能满足生物样品检测要求,采用HPLC-MS/MS的分析方法能准确稳定地对CVB-D进行定量分析。3、30%的乙醇能够明显提高探针的回收率,因此可以用做CVB-D的灌流液改性剂。4、本研究成功建立了微透析采样技术在大鼠血液和脑部同时采样的方法,同时,微透析样品经处理后,稳定性好,专属性强,回收率高,该方法可以用于CVB-D微透析样品的处理。通过比较其给药后脑局部和血液的药动学参数结果证明鼻腔给药后脑内药物浓度更高,存在有一定的脑靶向优势。5、通过优化的离子交联方法确定了壳聚糖纳米粒的完整制备工艺。6、结果证明本研究中制备所得的CVB-D CS-NPs具有较强的脑靶向性,并且药物经鼻腔给药后进入脑组织途径可能是嗅球通路、三叉神经通路与体循环的综合结果。