论文部分内容阅读
N-杂环化合物存在于工农业废弃物中,具有致癌、致畸、致突变等性质。尼古丁作为N-杂环化合物的一种,是高毒性的环境污染物。利用微生物去除尼古丁等环境污染物是最为可行的修复方法。课题组前期分离获得了一株高效降解尼古丁的菌株——恶臭假单胞菌S16(Pseudomonas putida S16),它采用吡咯途径代谢尼古丁。然而,假单胞菌属细菌代谢尼古丁的吡咯途径还很不完整:2,5-二羟基吡啶代谢的途径没有被揭示;转化3-琥珀酰吡啶(SP)的关键酶及其基因未知。另外,假单胞菌属细菌代谢尼古丁的调控机制还没有被报道。本论文在前期菌株S16全基因组测序和比较基因组分析的基础上,克隆获得了马来酸异构酶基因iso,在大肠杆菌中异源表达,验证了其编码产物Pp-Iso为菌株S16中催化尼古丁代谢吡咯途径最后一步(马来酸生成富马酸)的酶。在过去的几年中,课题组为了寻找尼古丁代谢吡咯途径中催化3-琥珀酰吡啶(SP)生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶(HSP)的酶已作出了很多努力,包括基因组文库筛选、野生蛋白纯化等,但并未获得目的基因。本论文在菌株S16基因组和差异蛋白质组的基础上,通过序列分析定位了菌株S16中编码转化SP生成HSP酶的基因簇spmABC,其由3个重叠的基因spmA、spmB和spmC组成。构建了spmABC基因簇失活的突变株,在生长体系和休止细胞体系中验证了异型多聚体SpmABC的功能为SP羟化酶。然而在大肠杆菌中没有表达出有活性的SP羟化酶,分析文献发现,钼喋呤胞嘧啶二核苷酸(MCD)是SP羟化酶必不可少的辅因子,而且大肠杆菌不能合成MCD。因此,我们构建了spmABC基因簇回补的突变株,并在假单胞菌中成功表达了有活性的SP羟化酶。尼古丁代谢的生理生化机制已基本清楚,然而调控方面的研究开展的很少。本论文以菌株S16中nic2基因簇(包括基因hspB,orf5,iso,hpo,nfo和ami)为研究对象,研究了尼古丁代谢吡咯途径的调控机制。定位了假单胞菌属细菌中第一个参与尼古丁代谢的调控基因nicR2,构建了基因nicR2失活和回补的突变株,验证其功能为nic2操纵子的阻遏蛋白。凝胶阻滞和DNase I footprinting实验确定了NicR2的结合位点包含28 bp的回文序列,其效应物是HSP。进一步对菌株S16中调控蛋白NicR2与DNA的结合机制进行了研究,通过大分子相互作用实验确定了两个NicR2二聚体协同结合到DNA上,并通过凝胶阻滞实验确定了对NicR2的协同结合起到关键作用的DNA序列为(“CTATATGN6~8CATATAA”)。首次证实了回文序列的半位点(half-site)能够结合NicR2,并通过凝胶过滤和蛋白交联实验检测到了NicR2四聚体,暗示NicR2蛋白-蛋白之间存在相互作用。在此基础上,本论文提出了一种新的HTH型调控蛋白结合DNA的模型:调控蛋白以四聚体的形式特异地结合一个回文序列,每个二聚体结合回文序列的一个半位点。这种结合方式不同于其他用HTH结合DNA的蛋白,反而与某些β-片型调控蛋白结合DNA的方式类似。本研究丰富了原核生物转录调控的多样性。