淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是目前全球发病率最高的性传播疾病之一——淋病的病原体。据估计，每年约有6.2亿患者。我国卫生部公布的2004年全国传染病发病率前五位中，淋病位居于第四位。淋病严重危害人类健康，该疫情的逐年迅速增加和持续蔓延趋势，对社会经济和人民健康都产生了严重影响，对家庭稳定和社会安定都具有极大地危害。人类对淋病奈瑟菌易感，且几乎没有免疫力，也没有成熟疫苗。感染早期虽然可用大剂量抗生素治愈淋病患者，但随着淋病奈瑟菌耐药率的逐渐升高，直接影响到对淋病的治疗效果及现场防治工作质量。因此，研究开发有效疫苗乃是控制和消灭淋病的最佳策略。　　本研究工作分以下四个部分:　　一、淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PorⅠB疫苗的构建、鉴定和表达　　以GenBank提供的已知淋病奈瑟菌PorⅠB基因序列为模板，设计合成一对引物，采用PCR技术从淋病奈瑟菌捷克标准株基因组中获取目的基因片断，PCR产物经酚:氯仿:异戊醇抽提后以乙醇沉淀纯化;纯化产物和载体质粒pET-28a(+)经NheⅠ、BamHⅠ酶切后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段和质粒大片段，经T4连接酶连接;连接产物以低温CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α中，经过卡那霉素抗性、双酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为pET-PorⅠB。测序结果与基因文库中的淋病奈瑟菌PorⅠB基因和氨基酸序列进行BLAST分析。DNA测序证实目的DNA与GenBank收录的(AF090801)比对，核苷酸有99.28％相同。有7个碱基发生了变异，推导其蛋白质一级结构中有6个氨基酸发生了置换，一个为同义突变，造成的氨基酸改变为134Asn→Asp,218Ile→Val,255Arg→Gly,328Glu→Ala,335Thr→Ile,342Val→Gly，氨基酸有98.14％相同。阳性重组体以低温CaCl2法转化到大肠杆菌DE3(BL21)中，于LB培养基中37℃扩增过夜，转至另一LB培养基，再扩增3h，以1mmol/L IPTG（终浓度）诱导6小时，提取细菌。细菌离心沉淀经洗脱法提取包涵体。粗提的包涵体尿素溶液用透析袋进行透析复性外膜蛋白PorⅠB。采用逐步降低尿素浓度的方法除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。SDS-PAGE显示在35.0～45.0kDa位置有一明显符合预期40 kDa大小的条带，扫描分析显示目的蛋白约占总菌体蛋白的25％～35％。这些数据提示我们成功构建了淋病奈瑟菌主要外膜蛋白抗原(PorⅠB)的原核表达系统，且表达成功。　　二、淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PorⅠB免疫原性及免疫反应性的观察　　1、将1mg纯化的PorⅠB溶解在0.5ml蒸馏水中，配以0.5ml福氏完全佐剂分4个不同点注射到大耳兔背部皮下进行初次免疫，以后每隔两周用同样剂量蛋白配以不完全福氏佐剂连续免疫4次，注射部位同前。每次免疫前耳静脉取血，制备血清，第10周心脏取血处死动物。采用ELISA法，以纯化的PorⅠB为包被抗原，将不同时间段（0、4、6、8、10周）的大耳兔免疫血清倍比稀释，二抗为HRP-羊抗兔IgG，反应体系用酶标仪读取0D值。结果显示，抗体水平随着免疫时间的延长逐渐升高，第8周末达到最高，0D值达0.1962，持续至第10周，未再升高;对照组血清1∶2稀释未检测到阳性反应。　　2、初次免疫3周后，用纯化的PorⅠB抗原注射大耳兔腿部皮内，注射剂量为50ug，对侧肢体相应部位注射同等体积生理盐水作对照。48小时后注射部位出现明显的红肿，第4天红肿消退，而生理盐水对照部位未见反应。该疫苗免疫后可诱发动物细胞免疫反应。　　3、在免疫血清中加入活的淋病奈瑟菌，37℃15min孵育后，继续加入新鲜正常小鼠血清（含补体），再孵育30min，反应体系倒入巧克力固体培养基上进行培养，24～48小时未见细菌生长，细菌杀死率达100％;未加正常小鼠血清对照组（仅含抗原抗体）培养基上细菌数减少＞20％，＜50％。生理盐水对照组培养基上长满细菌。结果说明免疫血清中的抗体在补体协同作用下能杀死淋病奈瑟菌。　　三、淋病奈瑟菌DNA疫苗pCI-PorⅠB的构建、鉴定和体内表达　　1、淋病奈瑟菌DNA疫苗pCI-PorⅠB的构建、鉴定　　根据淋病奈瑟菌外膜蛋白PorⅠB基因序列设计一对携带限制性内切酶(EcoRⅠ，SalⅠ)的引物，采用PCR方法从质粒pET-PorⅠB中获得PorⅠB基因片断，PCR产物经酚:氯仿:异戊醇抽提后以乙醇沉淀纯化;纯化产物和载体质粒pCI-neo经EcoRⅠ，SalⅠ酶切后行凝胶电泳回收目的片段和质粒大片段，连接酶连接;连接产物转化到感受态细胞中，经热休克处理，氨苄青霉素抗性、双酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为pCI-PorⅠB。　　2、淋病奈瑟菌DNA疫苗pCI-PorⅠB体内表达　　6只BALB/c小鼠分成3组，每组2只，分别注射DNA疫苗pCI-PorⅠB、空白质粒pCI-neo和生理盐水，100ug/35ul/只，初次免疫后10天同剂量行加强免疫一次。末次免疫4天后处死小鼠，取双侧股四头肌作石蜡切片。采用免疫组化方法检测DNA疫苗pCI-PorⅠB在小鼠骨骼肌细胞的表达。结果发现，DNA疫苗在小鼠骨骼肌细胞膜和细胞浆中均获得PorⅠB的表达，表明淋病奈瑟菌主要外膜蛋白抗原(PorⅠB) DNA疫苗pCI-PorⅠB构建成功。　　四、淋病奈瑟菌DNA疫苗接种及杀菌效果的观察　　1、淋病奈瑟菌DNA疫苗接种　　30只BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只，分别注射DNA疫苗pCI-PorⅠB（100ug/35ul/只）、空白质粒pCI-neo（100ug/35ul/只）和生理盐水（35ul/只），初次免疫后第3周和第6周各加强免疫一次。分别于第0周（免疫前）、第3、6、8、10、12、16、18周，自小鼠尾静脉取血，100ul/只，收集血清，第22周自眼眶取血收集血清。同时在6、8、12周用100ul pH7.0 PBS冲洗每只小鼠阴道，收集阴道分泌物。采用ELISA方法分析小鼠免疫前后血清特异性IgG抗体水平，以及体外溶菌试验观察免疫血清和阴道分泌物的杀菌效果。结果显示，血清特异性IgG抗体随着免疫时间的延长，效价逐渐升高，到第10周达到最高值(1∶1200)，维持到第12周后开始逐渐下降，至第18周降低到最低水平。　　2、DNA疫苗杀菌效果的观察　　在免疫血清及阴道分泌物中分别加入活的淋病奈瑟菌，37℃15min孵育后，继续加入新鲜正常小鼠血清（含补体），再孵育30min，反应体系倒入巧克力固体培养基上进行培养，24～48小时后观察结果。另一组反应体系（抗原抗体复合物）不加补体作对照;生理盐水作阴性对照。　　免疫血清在补体协同作用下能彻底杀死细菌（培养基上未见细菌生长）;阴道分泌物在补体协同作用下杀菌能力不如免疫血清，但比阴性对照及无补体参与的抗原抗体复合物对照有显著的杀菌作用，细菌数减少约80％，阴性对照培养基上长满细菌，抗原抗体复合物对照培养基上细菌数量明显少于阴性对照，但比有补体参与的抗原抗体复合物培养基上细菌数量多，细菌数减少约20％～30％。　　3、迟发型超敏反应(DTH)　　DNA疫苗初次免疫后一周，给小鼠足垫注射少许PorⅠB蛋白。48小时DNA疫苗组小鼠诱发针对PorⅠB蛋白的DTH反应，免疫小鼠的足垫出现明显的红肿，于注射后第3天消失，而空白载体组及生理盐水组则未见反应，可见DNA疫苗免疫小鼠后可诱发针对PorⅠB的DTH反应。　　结论:淋病奈瑟菌主要外膜蛋白抗原(PorⅠB)的免疫保护作用在国内未见报导。本研究用分子生物学技术成功构建淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PorⅠB疫苗及DNA疫苗pCI-PorⅠB;用纯化的表达蛋白PorⅠB免疫日本大耳白兔和用DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，两种动物均产生免疫保护反应;免疫后血清和阴道分泌物体外证实有杀菌作用。由于蛋白疫苗需要纯化，在批量生产时，工作量大，且蛋白疫苗需重复接种才能达到较好的免疫效果等问题的存在，DNA疫苗就凸显出它的巨大优势。DNA疫苗制备过程远比重组蛋白疫苗简单，规模生产不需大量投资，易于进行质量控制，造价低廉，且热稳定性好，不需要冷藏，这些优点决定了DNA疫苗是一种有发展潜力的核酸疫苗。