论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球约20亿人被证明有HBV感染,其中3.5亿人为HBV慢性感染,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。近年来由于非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率逐年增加,导致肝细胞脂肪变与慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)在同一个体中合并存在的病例明显增多,对两者相关性的研究逐渐受到重视。但迄今为止,HBV与非酒精性脂肪肝的关系尚未明确。流行病学调查显示CHB患者肝脂肪变的患病率相差很大(3%~76%),已有多项研究表明HBV与脂肪肝联系密切,且为脂肪肝的危险因素。但另有研究表明CHB患者肝细胞脂肪变的发生主要与宿主的代谢因素相关(如年龄、肥胖、血脂水平和代谢综合征等因素),而与病毒因素(如HBeAg和HBV-DNA载量等)关系不密切。因此HBV与脂肪肝的关系有待于进一步的研究。此次研究从群体和细胞两个角度探讨HBV与肝细胞脂肪变的关系及其可能的作用机制,并确定与肝细胞脂肪变有关的HBV编码蛋白。该研究结果不仅有助于判断HBV感染者患非酒精性脂肪肝的风险,加深人们对HBV致病机制的认识,更为有效地进行脂肪肝的防治提供理论基础,这对HBV高发国家具有特别重要的现实意义。一、HBV感染与非酒精性脂肪肝关系的病例对照研究采用病例对照研究方法,应用多因素统计学分析法控制混杂因素的影响,探讨HBV感染血清标志物、感染模式、HBV-DNA载量及病毒与宿主因素的交互作用与非酒精性脂肪肝的关系。研究结果显示:NAFLD组中HBV总感染率(84.16%)高于对照组(69.21%)(P<0.05),控制混杂因素影响后,HBV感染者发生NAFLD的风险(OR)为3.15(95%CI:1.18~5.50);在10种感染模式,有六种感染模式与NAFLD发生密切相关,其中HBsAg、Anti-HBe、Anti-HBc三项均阳性的感染模式患NAFLD的危险性最高,OR为6.47(95%CI: 2.90~14.44);其次分别为感染模式6(HBsAg、Anti-HBc二项阳性)、模式7(Anti-HBs、Anti-HBc二项阳性)、模式5(Anti-HBs、Anti-HBe、Anti-HBc三项阳性)、模式4(Anti-HBe、Anti-HBc二项阳性)和模式3(Anti-HBc单项阳性)的危险性相对较高;HBV感染与HDL-C异常存在协同致非酒精性脂肪肝的作用(P交互作用=0.034);没发现HBV-DNA检出率及平均滴度与非酒精性脂肪肝存在关联。二、乙型肝炎病毒对脂类代谢相关蛋白的影响根据已有的蛋白质组学研究结果,在HBV肝细胞系模型(pREP-HBV)的基础,结合瞬时转染的方法,从蛋白和mRNA水平进一步验证HBV对脂类代谢相关蛋白,包括载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,APOA1),载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE),锰超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2 ,SOD2),依赖还原型辅酶I/II:醌氧化还原酶(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1,NQO1),肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 1,FABP1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT2)的影响。研究结果显示:与对照细胞株相比,RHBV-3细胞株中ApoAI、APOE、SOD2和NQO1基因的蛋白和转录水平表达下调,FABP1基因蛋白和转录水平表达上调,变化趋势与蛋白质组结果一致,ACAT2表达没明显变化。为了进一步验证HBV对脂类代谢相关蛋白的影响,将含HBV全基因组的重组质粒pRep-HBV和对照质粒pRepsal分别转染HepG2、Huh7和YY细胞。结果显示,HBV对HepG2、Huh7和YY细胞SOD2、NQO1和FABP1三个基因的蛋白和转录水平均有影响,其中SOD2、NQO1基因的蛋白和转录水平表达下调,FABP1基因的蛋白和转录水平表达上调,变化趋势与蛋白质组结果一致;HBV可使HepG2细胞的ApoAI蛋白水平表达下调,但对ApoAI转录水平没有影响;HBV对HepG2、Huh7和YY细胞的ApoE和ACAT2基因蛋白表达水平均没有影响,但HBV可使三株细胞的ApoE基因转录水平表达下调及ACAT2基因转录表达水平上调,变化趋势与蛋白组学结果一致。比较细胞株和瞬时转染实验的分析结果,发现在上述六个脂类代谢相关蛋白中,SOD2,NQO1和FABP1瞬时转染实验分析结果与细胞株实验分析结果完全一致,且mRNA表达变化趋势与其翻译产物(蛋白质)表达变化趋势相同。上述研究结果表明HBV整体水平对脂类代谢相关蛋白表达具有影响,特别是对SOD2,NQO1和FABP1三个蛋白表达的影响尤为明显,该结果为HBV致肝细胞脂肪变作用机制的深入研究打下良好基础。三、乙型肝炎病毒蛋白对SOD2,NQO1和FABP1表达的影响应用AdEasy XL System构建HBV编码蛋白的重组腺病毒Ad-X、Ad-S、Ad-MS、Ad-LS、Ad-C、Ad-E、Ad-P和空病毒(Ad0),从蛋白和mRNA水平探讨HBV编码蛋白与特定宿主细胞中SOD2,NQO1和FABP1表达的对应关系。研究结果如下:成功构建可分别表达HBV X、CORE、E、S、MS、LS、P蛋白的重组腺病毒;与空病毒Ad0感染组相比,HBx可导致HepG2细胞SOD2和NQO1的转录和蛋白水平表达下调,FABP1的转录和蛋白水平表达上调;HBV主蛋白(S)可使HepG2细胞FABP1的转录和蛋白水平表达上调,SOD2和NQO1的转录水平下调;HBV中蛋白(MS)可使HepG2细胞SOD2的蛋白水平表达下调,但三个基因的转录水平没有明显变化;HBV大蛋白(LS)可使HepG2细胞FABP1蛋白表达水平上调,但三个基因转录水平均没有明显变化;HBV聚合酶(polymerase,P)蛋白对HepG2细胞三个基因的蛋白表达水平均没有明显影响,但可使SOD2和NQO1转录水平表达下调;HBV CORE蛋白对HepG2细胞三个基因的蛋白和转录水平均无影响;HBV E蛋白使HepG2细胞SOD2的蛋白和转录水平表达下调及NQO1转录水平表达下调。上述结果提示,在HBV 7个蛋白中,HBx蛋白及主蛋白对SOD2,NQO1和FABP1表达的影响尤其明显,因此,HBx和主蛋白可能在HBV相关的肝细胞脂肪变发生发展中起着重要作用。