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研究背景与目的:
缺血再灌注损伤(ischemia/rcperfusion injury)是临床上冠心病人常见的一种严重心肌损伤。如何减轻心肌缺血再灌注损伤,恢复心肌供血,保护心肌细胞成为治疗冠心病的关键。治疗性血管新生(therapeutic angiogensis)指通过适当干预,增加功能性血管分支及侧支循环开放,以恢复缺血再灌注损伤后缺血心肌供血,达到改善/治疗冠心病目的。近年来,本导师组一直致力于巴戟天糖链促进治疗性血管新生的作用及机制研究,并证实巴戟天糖链可促进鸡胚绒毛尿囊血管生成作用、增加MVD的数量:提高乳鼠缺血心肌微血管密度,诱导与血管新生相关的PDGF-β、TRPC6、VEGF、ERK1/2、bFGE等促进血管新生蛋白表达,促进成肌细胞增殖和分化,促进缺氧复氧损伤后内皮细胞迁移和血管管腔样结构生成等。巴戟天糖链促进血管新生的机制较为复杂,因此,本课题将通过观察巴戟天糖链对缺氧复氧损伤后的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Notch信号转导通路中Notch1,Jagged1的蛋白表达,探讨巴戟天糖链在促进血管生成过程中信号转导的潜在机制并提供理论支持。
方法:
1人脐静脉内皮细胞培养及缺氧复氧损伤模型制备与确定
将HUVEC细胞接种到75ml培养瓶内,给予含10％新生牛血清的RPMI1640高糖培养基,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。选取3～7代生长状态良好,长满80%左右的细胞,加入5ml缺氧液并不间断通入95%N2,5%CO2混合气体,造成缺氧损伤。1h后将缺氧液吸去,用室温PBS清洗一遍,加入5ml复氧液并置于3712,5%CO2,饱和湿度培养箱中,造成复氧损伤。2h后将复氧液弃去,加入室温PBS清洗一遍后,分别加入经过不同处理培养基,继续置于培养箱内培养,24h后显微镜下观察细胞状态。
2实验分组实验分6组(1)正常细胞组(2)缺氧复氧损伤模型组(3)缺氧复氧损伤模型+麝香保心丸药液组(阳性药物对照组)2g/L(4)缺氧复氧损伤模型+MOO小剂量组50mg/L(5)缺氧复氧损伤模型+MOO中剂量组150mg,L(6)缺氧复氧损伤模型+MOO大剂量组450mg/L
3检测方法(1)采用免疫组化SP法定性检测Notch通路蛋白表达情况。(2)采用Western-Bloting蛋白印迹法定量测定各组Notch信号转导通路蛋白表达变化。
4统计学处理结果用SPSS17.0软件行统计学分析。计量资料数据用均数士标准差(x±s)表示。检验结果均取α=0.05作为检验水准。组间比较采用单因素方差分析,当差异有显著差异时进一步用LSD法进行两两比较。
结果：
1、倒置显微镜下可见正常HUVEC,胞核圆,胞膜清晰,多边梭形,铺路石样。损伤后细胞收缩变圆,形态不规则,细胞间隙变大并出现部分脱落。24h后,各给药组细胞均出现增殖,以MOO各组呈剂量依赖性的更为显著。
2、免疫组化SP法检测结果显示:Notch信号通路的主要信号分子Notchl和Jagged均在胞膜和胞浆中表达,除正常组呈弱阳性表达信号外,其余各组均呈阳性表达信号;模型组与正常组相比光密度值显著升高(p＜0.05);与模型组相比,各用药剂量组Notchl、Jaggedl光密度值均显著降低(P＜0.05);MOO3个剂量组之间光密度值均有显著差异。
3、Western-Bloting蛋白印迹法检测N0tch1和Jagged1蛋白结果显示:模型组与正常组相比,蛋白表达量明显上升(P＜0.05);与模型组相比,给药各组蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05),MOO各组蛋白表达呈剂量负相关。
结论：
1缺氧复氧损伤后人脐静脉内皮细胞中Notch信号通路的改变,可能是启动血管新生的关键因素之一。
2 MOO显著调控Notch1/Jagged1等主要信号分子蛋白表达,从而影响Notch信号通路的作用,是其促进治疗性血管新生的重要机制。