莲房多酚的亚临界水萃取、组成及活性评价

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本论文以莲房为原材料,采用亚临界水萃取(Subcritical water extraction,SWE)莲房中多酚类物质(Lotus seedpod polyphenols,LSPP),并与传统热水萃取(Hot water extraction,HWE)进行比较;采用HPLC-ESI-MSn分析LSPP的组成和结构,评价抗氧化活性、抗肿瘤细胞增殖活性以及储藏稳定性;研究莲房中不同聚合度多酚组分的抗氧化活性,并分析了LSPP低聚合度组分的组成;在此基础上,研究SWE多酚的动力行为,建立动力学方程,为LSPP的SWE过程控制研究奠定理论基础,同时也为LSPP的资源化开发与利用提供理论指导。本论文具体研究内容和结果如下:1.莲房多酚的亚临界水萃取工艺优化、活性评价及组成分析(1)基于单因素实验的结果,使用响应面法优化LSPP的SWE工艺。结果LSPP的最佳萃取条件为:萃取温度140℃、萃取时间20 min、水料比70 mL/g、亚硫酸氢钠添加量为4‰(W/V)。在最佳条件下,LSPP的得率为178.32 mg GAE/g DW,显著高于HWE(146.15mg GAE/g DW)。(2)采用AB-8大孔吸附树脂柱层析法分离/富集多酚,冷冻干燥后得到LSPP粉末。SWE的LSPP的总多酚(815.4 mg GAE/g DW)和总黄酮(1012.05 mg RE/g DW)含量均高于HWE。利用还原力测定、清除DPPH·、ABTS·+和NO2-活性评价LSPP的体外清除自由基和抗氧化活性。结果显示,与HWE相比,SWE的多酚具有更好的还原能力和自由基清除活性,其中对DPPH·、ABTS·+和NO2-的清除率分别为49.9%(7.5μg/mL)、62.4%(50μg/mL)和52.8%(100μg/mL)。结果说明,LSPP具有良好的抗氧化活性,莲房是天然抗氧化剂的潜在资源。(3)采用HPLC-ESI-MSn分析LSPP组成,并且比较两种萃取方法所得LSPP在组成上的差异。通过详细的HPLC-ESI-MSn信息分析,与文献比对,并使用标准品进行验证,鉴定出8种多酚类化合物(原花青素二聚体1、原花青素二聚体2、儿茶素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮素、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷和异鼠李素);定量了4种主要化合物,与HWE相比,SWE的多酚中原花青素二聚体1、原花青素二聚体2和儿茶素的含量略高,但槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量略低于HWE的多酚,这可能是导致两种萃取方法所得多酚的抗氧化活性差异的原因。此外,研究了SWE的LSPP对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,结果当LSPP为200μg/mL时,抗增殖率达到57.21%(P<0.05)表明LSPP对HepG2细胞具有良好的抗增殖能力。2.莲房多酚的稳定性和不同聚合度组分分析及抗氧化活性评价(1)采用乙酸乙酯萃取对LSPP进行分级,分别得到低聚合度的乙酸乙酯相(EAF)和高聚合度的水相(WF)的LSPP。评价了两种聚合度LSPP的抗氧化(还原力、清除DPPH·和ABTS·+)活性。与高聚合度组分相比,低聚合度组分具有更好的抗氧化活性;但两者的自由基清除能力均低于全组分LSPP(SWE),即自由基清除能力由高至低为:SWE>EAF>WF,说明不同聚合度多酚之间存在协同增效作用。(2)采用HPLC-ESI-MSn分析低聚合度LSPP的组成,鉴定了24种多酚类化合物[儿茶素、表儿茶素、原花青素二聚体(1、2、3和4)、原花青素三聚体(1、2、3和4)、(表)没食子儿茶素、(表)没食子儿茶素-(表)儿茶素1和2、(表)儿茶素-(表)没食子儿茶素1和2、(表)儿茶素-(表)儿茶素-(表)没食子儿茶素(1、2和3)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮素、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷],量化了22种多酚类化合物,主要为儿茶素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素类化合物。(3)初步评价了LSPP的储藏稳定性。LSPP在低温、避光、酸性条件下保存较稳定,食盐对LSPP的稳定性影响较显著,蔗糖和葡萄糖对LSPP有一定的保护作用。3.亚临界水萃取多酚类物质的动力学研究基于Fick第二扩散定律,在“单点动力学模型”的基础上,采用“两点动力学解吸模型”研究LSPP的SWE动力学行为。假设莲房颗粒是均匀的球形,溶质最初均匀分布在固体基质中,萃取不受溶解度、溶剂体积限制,Ct是t时间从每g基质中萃取的分析物质量(mg/g);C0是每g基质中分析物的初始质量(mg/g)。结果,在相同萃取时间下,随着萃取温度的升高,莲房中多酚、黄酮和原花青素三种成分的Ct/C0随之增加;在相同萃取温度下,三种成分的Ct/C0随着萃取时间的延长而增加,而且在萃取过程的前5 min内,三种成分的相对萃取率达到48%73%,在萃取过程的519 min内,相对萃取率增加到85%98%之间,表明SWE莲房中三种成分的过程分为快速阶段和慢速阶段,而且两点动力学解吸模型拟合良好(R2>0.992),说明该模型能很好地描述莲房中三种成分在SWE过程中的动力学行为;通过模型求得三种成分的解吸速率常数k1、k2、快速萃取的级分(F)和R2值。根据Fick第二定律和Arrhenius方程,分别得出三种成分的有效扩散系数(De)和可参考的活化能(Ea)。
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