球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus,Bs)是革兰氏阳性细菌(G+),能够形成芽胞,是蚊虫的致病菌。部分Bs菌株能够产生不同种类的杀虫毒素蛋白:在芽胞形成时期能够产生二元毒素蛋白(binary toxin,Bin);在营养生长时期则能够形成杀蚊毒素(mosquitocidal toxin,Mtxs)。其中Bin蛋白以晶体蛋白的形式合成并对库蚊(Culex pipiens)幼虫具有很高的毒力活性。近几十年,球形芽胞杆菌是被成功应用的微生物杀虫剂之一,并已经有了成熟的商业化产品。除了作为重要的生物杀虫剂应用于蚊虫的控制,Bs还具有包括不能利用糖类以及独特的氨基酸类有机物代谢途径等重要表型,具有重要的研究意义。　　 为了进行Bs的遗传改良,提高其杀蚊活性和扩大杀虫谱,本研究在分析其限制性修饰系统的基础上,建立了其遗传转化操作系统;同时,通过mariner转座子随机插入突变体库的构建,探讨其芽胞形成相关基因及其同杀虫晶体蛋白形成的关系。　　 Bs C3-41是一株重要的应用于蚊虫控制的菌株,其全基因组的测序以及基因的初步注释工作已经完成,但是该菌株难于转化。在线数据库REBASE的分析发现,凰C3-41中存在有6套不同的Ⅱ类限制修饰系统;限制性实验则发现BsC3-41的细胞抽提液能够将与其一起孵育的质粒DNA完全剪切降解。因此推测限制修饰系统的存在是Bs C3-41难于转化的重要原因之一。为了解决凰C3-41由于限制性导致的转化障碍,一个方法是质粒预先进行体外甲基化修饰的处理,处理后的质粒DNA成功转化 Bs C3-41并且转化效率很高,到达了104个转化子/μg质粒DNA,而未进行任何处理的质粒DNA转化Bs C3-41未能成功;另一方法则是删除菌株中限制修饰系统,由于pBsph上存在有3套Ⅱ型限制修饰系统,因此本研究直接选择了质粒pBsph消除突变株C3-41△pBsph作为限制性修饰系统删除的菌株,结果是体外修饰处理和未作任何处理的质粒DNA都能够成功转化C3-41△pBsph,未处理的质粒转化效率较低,为25个转化子/μg质粒DNA,而处理后的质粒则也有104个转化子/μg质粒DNA转化效率。上述实验结果表明限制修饰系统在影响球形芽胞杆菌转化效率中具有重要的作用。本研究提供了两种不同的策略解决Bs C3-41的转化难题,即质粒DNA体外甲基化修饰和删除菌株特有的限制修饰系统。进一步对Bs C3-41转化条件进行了优化,其最优转化条件是:菌株生长阶段为OD600为0.4-0.5,电击参数为13.5 kV/cm。　　 在营养缺乏的情况下,Bs通过一系列形态变化形成芽胞,同时伴随杀蚊晶体蛋白的形成。然而,仅仅只有一小部分芽胞形成相关的基因已经被鉴定,晶体蛋白合成的调控机制也几近空白。因此,开展Bs芽胞形成相关基因研究,探讨芽胞形成与晶体蛋白之间的相互关系具有重要的理论意义和实际应用价值,本研究构建了Bs2297的mariner转座子随机插入突变体库,并筛选了7株芽胞形成缺陷的突变株,并通过测序获得了转座子插入突变侧翼的DNA序列,鉴定了7个与芽胞形成相关的基因。后续通过超薄电镜的细胞形态观察、SDS-PAGE和Western blot晶体蛋白表达分析以及杀蚊活性实验,结果显示:芽胞形成中断在早期的突变株C06、D20、B41和N49不能形成晶体蛋白,并且杀蚊活性很低;而芽胞形成中断在后期的突变株Q43、P64和C78则能形成晶体蛋白并具有与野生菌株相当的杀蚊毒力。上述结果表明Bs的杀蚊晶体蛋白的合成是依赖于芽胞形成的起始。　　 本文一方面为杀蚊Bs的遗传改良的研究提供了技术方法和理论依据;另一方面为研究Bs的功能基因的研究提供良好的基础。