SARS-Cov主蛋白酶C端结构域(Mpro-C)单独在大肠杆菌中表达时存在单体和双体两种组分,其中双体是通过交换位于蛋白质疏水核心的α1螺旋形成的三维结构域交换双体。主蛋白酶(Mpro)也能够通过其C端结构域发生同样的三维结构域交换形成一种有酶活性的稳定八聚体。Mpro-C的单体和结构域交换双体在25℃时很稳定,数天内观察不到变化,温度升高到37℃时,能够观察到两者发生相互转化。本论文着重研究Mpro-C由单体转化形成结构域交换双体的机制,通过对单双体转化过程的化学动力学和热力学性质,Mpro-C单体的热稳定性和结构稳定性,Mpro-C在单双体能够相互转化的条件下的结构变化等多方面问题进行了一系列研究和探讨,为深入理解蛋白质三维结构域交换的发生机制提供了新的思路。　　Mpro-C单体和结构域交换双体能够在37℃接近生理条件的溶液中相互转化,33℃时的半衰期约为20小时,37℃时的半衰期约为2小时,显示出很大的温度依赖性。同时,单双体也能在25℃,2.5 M尿素溶液中相互转化,半衰期约为23个小时。Mprc-C单体聚合和结构域交换双体解离过程的活化能分别为377.6kJ/mol和435.7 kJ/mol,远高于蛋白质普通聚合过程的活化能,接近甚至超过蛋白质变性过程的活化能。　　Mpro-C单体的热变性中点温度为59.1℃,这表明37℃时Mpro-C单体仍处于折叠态,未发生大的结构变化。如果Mpro-C单体经过去折叠态转化生成结构域交换双体,根据Mpro-C变性过程的自由能变化估算37℃时去折叠态Mpro-C的含量可计算出最快转化速率,其结果远比实验中观测到的转化速率慢,因此Mprc-C由单体形成结构域交换双体并非通过完全去折叠态发生。核磁共振氢氘交换研究结果显示在能发生结构域交换的溶液条件中和不能发生结构域交换的溶液条件中,α1螺旋上的氨基酸残基的酰胺氢都需要整个蛋白质去折叠才能与溶液中的氘发生交换,说明两种溶液条件中均不存在蛋白质疏水核心瞬间打开使α1螺旋暴露于溶液中的状态,因此Mpro-C由单体形成结构域交换双体并非通过α1螺旋能瞬间暴露于溶液中的类熔球态发生。　　利用核磁共振技术解析了Mpro-C单体在25℃,2.5 M尿素溶液中的溶液结构,同时分析了Mpro-C单体在37℃溶液中的结构特征,结果显示Mpro-C在上述两种能发生结构域交换的溶液条件中具有共同的结构特征:11-106号氨基酸残基的结构与Mpro-C单体在不能发生结构域交换的溶液条件中的溶液结构基本一致,107-114号氨基酸残基呈无规则卷曲结构,不再形成α螺旋结构,并且活动性增加,同时α5螺旋和α1螺旋间的相互作用大量减少,据此推测Mpro-C中C末端在Mpro-C结构域交换过程中可能起到阻挡α1螺旋发生结构域交换的作用。切除Mpro-C中C末端110-120号氨基酸残基的突变体由单体形成结构域交换双体速度相比Mpro-C显著加快。切除109-120号氨基酸残基的突变体由单体形成结构域交换双体速度慢于切除110-120号残基的突变体。切除108-120号氨基酸残基的突变体不能形成结构域交换双体。Mpro-C的108号和109号氨基酸残基的不同点突变中,有突变体尽管稳定性相比Mpro-C减弱,但由单体形成结构域交换双体的速度却减慢。这表明C末端在Mpr～-C结构域交换过程中除起到阻挡α1螺旋发生结构域交换的作用外,还直接参与介导Mpro-C结构域交换过程的发生。此外,在能发生结构域交换的溶液条件中,发现两个Mpro-C分子可以通过呈现无规则卷曲构象的C末端彼此间发生相互作用,从而自聚合。自聚合能够有效降低发生结构域交换过程中能量的不利变化,因此有利于α1螺旋发生结构域交换。综合以上研究结果,提出Mpro-C单体转化形成结构域交换双体的模型:首先,C末端发生构象变化,由α螺旋形成无规则卷曲结构,呈现无规则卷曲结构的C末端通过介导两分子Mpro-C自聚合从而介导结构域交换的发生。这是第一次报道蛋白质发生结构域交换的过程能够被非交换的其他结构单元所介导和调控,这深化了对结构域交换发生机理的认识和理解。