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在低氧时肺是最容易受到损伤的器官之一,肺水肿是低氧导致的严重结果,可危及生命,已知跨肺泡上皮的钠转运功能障碍是肺水肿发生的重要机制之一。正常情况下,钠从肺泡腔内的上皮细胞主动转运入血,引起水依渗透压梯度吸收入血,这是肺泡液体吸收的主要机制。低氧能降低肺泡上皮屏障功能,抑制肺泡上皮钠摄取和液体的清除,而外源性给予糖皮质激素(glucocorticoid,GC)能够加速肺泡腔液体的重吸收和清除,因此在临床上GC被用来有效治疗严重的肺水肿。近年来的研究表明GC能提高肺上皮细胞钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)的活性,但是GC如何调节ENaC活性的具体机制不详。Stomatin是一种膜上的脂筏蛋白,该蛋白具有脚手架功能,推测能与多种膜蛋白,如离子通道、转运子、骨架蛋白和信号转导蛋白等结合,并影响其功能。国外的研究表明stomatin在线虫中的同系物MEC-2能够增加钠通道的开放,提示stomatin可能在GC调节ENaC方面发挥作用。本研究采用real-time PCR和Western blot的方法,观察了低氧单独或与GC联合作用对人肺癌细胞系A549细胞和大鼠肺组织中stomatin表达的影响,以及这些变化和肺水肿发生的可能关系,以探讨低氧应激时stomatin的表达改变和可能的机制,为今后进一步研究stomatin的生物学功能以及作为糖皮质激素/糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)调节的靶蛋白在GC低氧适应中的作用打下基础。
一、低氧、糖皮质激素单独或者联合作用对A549细胞stomatin表达的影响
首先观察了人工合成的糖皮质激素-地塞米松(dexamethasone,Dex)对A549细胞内stomatin表达的影响。于含10％去激素血清培养基培养的A549细胞中加入不同浓度Dex处理12h,或者用10nM浓度Dex处理细胞不同时间后,抽取细胞的RNA,用real-time PCR方法检测stomatin mRNA的表达,结果发现Dex能以时间和浓度依赖的方式诱导stomatin mRNA的表达,10nM浓度Dex处理细胞12h后,其stomatin mRNA的表达量约为对照细胞的4倍(p<0.01)。用Western blot的方法证实GC也能诱导A549细胞stomatin蛋白的表达。我们进一步发现GR的阻断剂RU486能明显阻断GC对stomatin表达的上调作用,表明GC对stomatin表达的影响是通过GR来实现的。接下来我们观察了低氧对A549细胞内stomatin mRNA和蛋白表达的影响。将生长密度为90％左右的A549细胞培养基换成含10％去激素血清的培养基,然后将细胞置于含有1％O2的低氧孵箱,在低氧条件下培养细胞不同时间后测定其stomatin mRNA和蛋白的表达,结果发现低氧处理2h后stomatin mRNA就明显上调(p<0.05),并随着低氧时间的延长上调更明显,低氧24h后stomatin mRNA的表达量约是对照组的3.4倍(p<0.01)。蛋白表达的检测结果表明低氧也能以时间依赖的方式上调stomatin的表达,低氧处理细胞4h后stomatin蛋白表达即开始上调,低氧32h后stomatin蛋白的表达量增加更为明显。
我们进一步观察了低氧、GC单独或联合作用12h对A549细胞stomatin mRNA表达的影响。结果发现经低氧、Dex单独处理的A549细胞stomatin mRNA的表达量分别为对照组的2倍(p<0.05)、5倍(p<0.01),而二者联合处理后stomatin mRNA的表达则上升至对照组的7倍左右(p<0.01)。上述处理方式同样能够影响A549细胞stomatin蛋白的表达,Dex单独上调的作用强于低氧单独作用的结果,而两者共同处理后stomatin蛋白的表达进一步增多。
二、低氧和糖皮质激素对大鼠肺组织stomatin表达的影响
将大鼠放入充有8％O2、92％N2混合气的低氧舱内低氧暴露不同时间,检测大鼠肺组织stomatin mRNA的表达情况。结果显示大鼠肺组织stomatin mRNA的表达在低氧处理8小时后即有上调,约为对照组的1.7倍(p<0.05),之后逐渐降低,24h时接近对照组的水平。已有实验表明低氧暴露的动物血中糖皮质激素明显增高,而我们上述实验已证明GC可诱导stomatin的表达。为了确定GC在机体上调stomatin表达的过程中发挥了多大的作用,我们摘取了大鼠的肾上腺以去除内源性激素对stomatin表达的影响。我们先观察了低氧12h正常大鼠的肺组织stomatin mRNA的变化,结果表明stomatin mRNA的表达明显增加,约为常氧组大鼠的2倍(p<0.01),但是当低氧组和常氧组大鼠均去腺后,这种表达差异变的不明显。我们进一步将大鼠随机分为假手术常氧对照组、其余去腺后分为常氧组、低氧组、Dex组和低氧加Dex共处理组。对肺组织stomatin mRNA的检测结果显示,去腺常氧组大鼠stomatin mRNA的表达与假手术常氧对照组相比略有降低,但差别不明显。去腺低氧组大鼠stomatin的mRNA与去腺常氧组大鼠相比虽然轻度升高,但差别也不明显。去腺Dex组大鼠肺组织stomatin mRNA的表达比单独去腺组明显增高,而去腺大鼠用Dex和低氧联合处理,stomatin mRNA的表达增加更为明显。表明在体内低氧上调stomatin的表达依赖于Dex,而且低氧能明显增强Dex上调stomatin的作用。
三、低氧对肺水肿发生的影响
观察了低氧暴露不同时间后大鼠肺水肿发生的情况,并与stomatin的表达变化进行了比对,以初步探讨其表达与肺组织水肿发生之间可能的相关性。组织学的检测结果显示,低氧处理8h和16h的大鼠与对照大鼠相比肺血管明显充血,肺泡间隔增宽,肺泡内出现水肿液,证明低氧大鼠出现了肺水肿,低氧处理24h的大鼠肺水肿有所减轻。我们又检测了判定大鼠肺水肿的另外两个指标一肺组织湿干比、肺系数,结果表明与对照组相比,低氧8h组肺系数增高最明显(p<0.05),16h、24h组有所降低,与组织学的检查结果一致。另外,我们还发现低氧和Dex联合处理组大鼠肺组织stomatin的表达水平最高,而肺水肿的表现也最轻,提示stomatin的增多有减轻肺水肿的作用,推测stomatin有可能通过调节肺上皮细胞的钠通道促进肺泡水肿液的清除,这方面还需要进一步实验来证明。
综上所述,低氧、糖皮质激素都能上调A549细胞stomatin的表达,糖皮质激素的作用强于低氧,两者联合作用具有协同效应。低氧也能明显上调大鼠肺组织stomatin的表达,该作用需要糖皮质激素受体的存在,而且低氧能明显增强Dex上调stomatin的作用。进一步实验发现大鼠低氧暴露后stomatin的表达水平与肺水肿的严重程度呈负相关,推测stomatin有可能通过提高肺上皮细胞钠通道的活性和稳定细胞骨架来促进肺泡水肿液的清除,防止肺水肿的发生和发展。