论文部分内容阅读
2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺是合成咪唑啉酮类超高效除草剂的通用中间体,市场需求量大,由于其传统化学法原料消耗多,环境污染严重,生物法合成2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺具有巨大的工业化价值。2-氨基-2,3-二甲基丁腈（α-氨基腈）在水相中易解离出氰基,强烈抑制腈水合酶活性,因此获得氰基耐受型腈水合酶成为生物催化法生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的关键。本论文通过新型腈水合酶的筛选、培养及转化条件优化,初步建立了微生物腈水合酶法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的工艺。首先,采用富集培养法从土壤中筛选到一株具有催化2-氨基-2,3-二甲基丁腈水合为2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺能力的腈水合酶生产菌株ZJB-09141。氰基抑制性实验表明,该腈水合酶对氰化物具有较好的耐受性能。经菌落形态、生理生化试验、16S rRNA序列分析,菌株ZJB-09141鉴定为Nocardia globerula。对N.Globerula ZJB-09141的培养基成分和培养条件进行了优化。在单因素优化结果的基础上,采用Plackett-Burman（PB）设计法,对9种影响产酶的因素进行评价,结果显示酵母粉、蛋白胨和己内酰胺对N.globerula ZJB-09141产腈水合酶的影响最为显著,通过Box-Behnken设计考察了这三个主要因素对菌株腈水合酶活力的影响,得出了这三个因素的最佳浓度为:酵母粉5.46 g l-1,蛋白胨2.39 gl-1,己内酰胺3.77 g l-1。采用优化后的发酵培养条件进行摇瓶发酵培养,腈水合酶的酶活达到9.36 U ml-1,比优化前的初始发酵培养条件下的酶活提高了22.9%。最后,论文研究了转化条件对产物合成过程的影响。结果显示,该酶进行催化反应的最适pH为7.2,最适催化温度范围为30-35℃。考察了N.globerula ZJB-09141腈水合酶的温度稳定性,在30℃时,该酶具有较好的温度稳定性,而当温度高于40℃后,该酶迅速失活。通过双倒数作图法,求得了30℃条件下的反应动力学参数:Km=74.42mM,Vmax=6.734μmol min-1 mg·dcw-1。