研究背景和目的:随着经济的快速增长，社会竞争压力的增加，人们生活水平的提高，以及工作、生活方式和饮食结构的改变，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的发病率不断增加，已成为严重威胁人类健康的常见疾病。糖尿病易并发心血管疾病，已成为糖尿病病人致残、致死的主要原因，尤其是糖尿病心肌病(DiabeticCardiomyopathy， DCM)近年来备受关注。人们已经认识到，糖尿病心肌病是糖尿病病人所特有的并发症，不能用高血压病、冠心病、心瓣膜病以及其他心脏疾病来解释的独立性心肌疾病。糖尿病心肌病的主要表现是先出现左心室舒张功能障碍，并左心室顺应性降低及左心室肥厚，然后发展为收缩功能受损、左心室扩张，并心律失常和心力衰竭。糖尿病心肌病的主要病理改变是心肌微血管内皮细胞损害，内膜下纤维增生，血管基底膜增厚，心肌间质炎症和纤维化，心肌细胞肥大、凋亡。然而有关糖尿病心肌病的发生机制却不完全清楚。近年来有文献报道，线粒体功能障碍与糖尿病心肌病有关。我室前期研究发现，糖尿病大鼠血中内源性一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase，NOS)抑制物非对称性二甲基精氨酸(Asymmetricdimethylarginine，ADMA)含量明显升高，不仅与糖尿病内皮功能不全和大血管并发症密切相关;而且近年来还研究发现，糖尿病大鼠内源性ADMA升高也与心肌线粒体生物合成抑制和线粒体功能障碍有关;但尚未探讨糖尿病内源性ADMA升高与心功能不全的关系。NOS抑制物对线粒体功能和心功能的直接作用均尚未见国内外文献报道。因此，本研究拟给正常SD大鼠腹腔注射外源性NOS抑制物NG-硝基-L-精氨酸（NG-nitro-L-arginine，L-NNA），观察对大鼠心功能和心肌线粒体功能以及线粒体生物合成的影响，并进一步从补充一氧化氮(Nitric oxide，NO)合成前体L-精氨酸（L-Arigine，L-Arg）和选用抗糖尿病药物二甲双胍（Metformin，Met）以增加线粒体生物合成的两个方面来探讨L-NNA对大鼠心功能和心肌线粒体功能与线粒体生物合成作用的影响，旨在证明内、外源性NOS抑制物对线粒体功能和线粒体生物合成的抑制作用，揭示ADMA在糖尿病心肌病中的重要作用及机制，为阐明糖尿病心肌病的发病机制提供新的实验数据，并为糖尿病心肌病的临床防治及药物研发提供新的启示。　　 方法:(1)动物实验:采用体重为150～180g的健康雄性SD大鼠，随机分为6组，①Control，②L-NNA组（30 mg/Kg/d），③L-Arg+L-NNA组(100 mg/Kg/d+30 mg/Kg/d),④Met+L-NNA组(125μg/Kg/d+30 mg/Kg/d),⑤L-Arg组(100 mg/Kg/d),⑥Met组（125μg/Kg/d）。第②、⑤和⑥组大鼠每天按提示的剂量腹腔注射相应药物，第③和④组大鼠每天先腹腔注射L-Arg100 mg/Kg或Met125μg/Kg，1h后再腹腔注射L-NNA30 mg/Kg;正常对照组每天腹腔注射等体积的PBS。造模8周后采用M型超声心动检测各组大鼠心脏形态及功能变化;10周后采用颈动脉插管的方法直接检测各组大鼠颈动脉及左心室血流动力学指标，并迅速摘取心脏称重，分离左心室乳头肌和胸主动脉，分别检测乳头肌对电刺激的收缩反应和血管环对乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应等心血管功能变化;用心肌组织中线粒体基因细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(CytochromeoxidaseⅠ，COXⅠ)与核基因β-actin的拷贝数比值、线粒体生物合成调节的关键基因过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子(Peroxisomeproliferation things co-activated factor receptorγ，PGC-1α)的基因转录及蛋白表达水平、线粒体解偶联蛋白2(Uncoupling protein，UCP2)mRNA水平和心肌组织中ATP含量检测以反映模型大鼠心肌线粒体功能变化;用RT-PCR和Western blotting蛋白印迹方法检测大鼠心肌组织中内源性ADMA的主要生成酶蛋白质精氨酸甲基转移酶1(Protein arginine methyltransferase1，PRMT1)、内源性ADMA的主要代谢酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethylarginiedimethylaminohydrolase，DDAH)和内皮型NOS(Endothelial NOS，eNOS)的基因转录及蛋白水平，以及用比色法检测心肌组织中NOS活性及NO代谢产物含量等来共同反映心肌组织中PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路的变化;另外还检测心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性以反映氧化应激水平。　　 (2)细胞实验:分别采用30 mmol/L的葡萄糖(Glucose，Glu)和100μmol/L的游离脂肪酸油酸(Oleinic acid，OA)、30μmol/L ADMA及30μmol/L L-NNA孵育新生SD大鼠乳鼠原代心肌细胞48h后，用线粒体膜电位的荧光探针JC-1检测心肌细胞线粒体膜电位的变化;用PCR和RT-PCR方法检测线粒体基因COXⅠ与核基因β-actin的拷贝数比值、UCP2基因转录水平;用Western blotting方法检测PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白和PGC-1α蛋白表达变化;并观察1mmol/L L-Arg和300μ mmol/L Met预处理后对原代心肌细胞线粒体膜电位和PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白表达改变的影响。　　 结果:(1)动物实验结果:①给正常SD大鼠腹腔注射内源性一氧化氮合酶抑制物L-NNA8周后，M型超声检测揭示心脏形态结构发生改变，如左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)及室间隔舒张末期厚度(IVSd)增加，左心室舒张末期内径(LVIDd)及左心室收缩末期内径增加，提示左心室壁肥厚，心脏结构发生重构;此外，反映心脏室间隔收缩幅度的IVSd％和反映左室后壁收缩幅度的LVPW％均明显降低;左室舒张末容量(EDV)，左心室射血分数(EF％)，短轴缩短率(FS％)也显著低于正常对照组大鼠;提示左心室收缩功能降低。②腹腔注射外源性NOS抑制物L-NNA的模型大鼠饲养10周后，大鼠心指数明显增加;从颈动脉插管至左心室检测颈动脉血压显示，大鼠颈动脉收缩压和舒张压、平均动脉压、平均舒张压和搏切迹压力较正常对照组均显著升高;离体胸主动脉环对乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)诱导的内皮依赖性舒张反应降低，提示外源性注射L-NNA可强烈收缩血管，抑制血管内皮依赖性功能。③外源性腹腔注射NOS抑制物L-NNA模型大鼠心肌COXⅠ/β-actin比值、线粒体生物合成调节的关键基因PGC-1α的mRNA和蛋白水平均明显低于正常对照组大鼠，提示心肌线粒体生物合成抑制;L-NNA模型组大鼠心肌组织ATP含量减少，线粒体解偶联蛋白UCP2 mRNA水平较正常组显著增加，提示L-NNA模型大鼠心肌线粒体功能障碍。④外源性腹腔注射NOS抑制物L-NNA模型大鼠心肌组织中PRMT1蛋白表达增加，但mRNA水平降低，DDAH1和DDAH2的蛋白及mRNA水平均降低，eNOS蛋白表达也明显降低，NO含量显著减少，提示PRMT1/DDAH/NOS/NO通路异常。⑤外源性腹腔注射NOS抑制物L-NNA模型大鼠心肌组织脂质过氧化产物MDA含量明显增高，而抗氧化酶SOD活性却显著降低，提示氧化应激增加。⑥无论是给予NO的合成前体L-Arg或增加线粒体生物合成的口服降糖药Met治疗10周后，均可不同程度地改善L-NNA对大鼠心脏结构与功能、血管内皮功能、线粒体功能、线粒体生物合成以及PRMT1/DDAH/NOS/NO通路的影响。　　 (2)细胞实验结果:在原代培养的SD新生大鼠心肌细胞，无论是采用高糖、高脂肪酸，还是内、外源性NOS抑制物ADMA和L-NNA孵育心肌细胞48h后，均能降低线粒体膜电位，上调线粒体氧化磷酸化解偶联蛋白UCP2基因转录水平;减低线粒体DNA含量，下调PGC-1α蛋白表达，提示内、外源性NOS抑制物与高糖、高脂肪酸同样具有抑制线粒体功能和线粒体生物合成的作用。此外，高糖、高脂肪酸和内、外源性NOS抑制物亦可上调原代心肌细胞PRMT1、DDAH和eNOS的蛋白表达，引起原代心肌细胞PRMT1/DDAH/NOS通路异常。分别采用NO合成前体L-Arg和增加线粒体生物合成的Met治疗后均可不同程度的改善内、外源性NOS抑制物所引起的上述变化。　　 结论:1、给正常SD大鼠长期腹腔注射外源性NOS抑制物明显增加外周动脉压力，这可能是由于抑制了血管内皮依赖性舒张功能所致;　　 2、长期注射外源性NOS抑制物可引起SD大鼠左心室壁肥厚、降低左心室泵血功能，这可能与外周动脉血压过高、心脏压力超负荷以及心肌线粒体功能障碍有关;　　 3、长期注射外源性NOS抑制物导致心肌线粒体功能障碍和线粒体生物合成抑制，这可能与增加氧化应激、上调UCP2基因转录、下调PGC-1α蛋白表达有关;　　 4、长期注射外源性NOS抑制物可致心肌PRMT1/DDAH/NOS/NO通路紊乱。