恶性肿瘤是威胁人类生命健康的头号杀手之一,手术、放疗、化疗和靶向治疗是目前恶性肿瘤治疗的主要方法,大部分患者诊断时已是局部晚期或有远处转移,失去手术机会。化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也不加选择性的造成了严重的损伤,毒副反应较大,许多患者因体质差或无法耐受毒副作用而放弃治疗。靶向治疗虽不良反应小,但其疗效与基因突变相关。因此,寻找其他高效、低毒的恶性肿瘤治疗新方法,是医学界面临的重要问题。声动力疗法(Sonodynamic therapy, SDT)是在光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)基础上发展起来的一种治疗恶性肿瘤的新理念、新方法。肿瘤患者口服或静脉注射声敏剂,而后用一定频率和强度的超声照射肿瘤部位,通过超声激活聚集在肿瘤部位的声敏剂,使其产生一系列声化学反应(如产生单态氧、自由基),导致肿瘤细胞的不可逆性损伤。与光动力疗法(激光激活光敏剂,产生单态氧或自由基,从而起到杀伤肿瘤的作用)相比,超声对人体组织有很强的无创穿透能力,无需借助其他介入手段即可对深部肿瘤进行治疗,故有着广阔的发展前景。目前SDT存在的主要问题是所用的声敏剂多为血卟啉及其衍生物为代表的第一代光敏剂,肿瘤靶向性不强,排泄缓慢,易发生光毒副反应,影响了SDT疗效及其临床实际应用。因此,寻找靶向性高、毒副作用小的新型声敏剂以及探索最佳的声动力治疗模式是必要的。Chlorin e6是一种结构类似于血卟啉的叶绿素降解产物,早先被应用于光动力治疗中,显示确切的抗肿瘤作用及肿瘤靶向性强、正常组织清除快、毒副反应低的优点。但是Chlorin e6作为声敏剂应用于声动力治疗恶性肿瘤的研究目前还比较少,我们前期的细胞学研究工作显示Chlorin e6具有在肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞特异聚集性和声动力治疗靶向杀伤肿瘤细胞作用,是一个有临床应用前景的声敏剂,但目前缺乏整体动物的肿瘤靶向特异聚集性和声动力作用的实验证据。因此,本研究的第一个目的是采用激光共聚焦显微镜观测Chlorin e6在S180肉瘤荷瘤小鼠肿瘤组织的富集情况。第二个目的是研究Chlorin e6联合超声对S180肉瘤的杀伤作用,探索理想的声动力治疗模式。第一部分Chlorin e6在S180荷瘤小鼠肿瘤组织和肌肉组织的分布目的研究Chlorin e6在肿瘤组织的富集情况,探索给药后最佳的超声辐射时间。方法S180肉瘤荷瘤小鼠腹腔注射Chlorin e6(10mg/kg),分别于给药后3、6、12、18、24、48、72h断颈处死小鼠,剥离肿瘤组织和周围肌肉组织,制备冷冻切片,并在激光共聚焦显微镜下测定和观察肿瘤和肌肉组织的荧光强度及荧光显像(显示为红色荧光)。采用SPSS13.0统计软件进行两个重复测量因素的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果腹腔注射后24h内,Chlorin e6(10mg/kg)在肿瘤及周围肌肉组织中的含量随时间递增,肿瘤组织含量明显高于周围肌肉组织,18h时达最高峰,且此时肿瘤组织和肌肉组织中的差异最明显,荧光强度相差6.14倍。后随着时间延长荧光逐渐减弱,24h后接近正常,72h后基本检测不到荧光。由此可见Chlorine6(10mg/kg)在腹腔注射后可靶向性富集于肿瘤组织,18h含量达到最高,且此时与正常组织的含量差异最明显。此时若对肿瘤进行辐照处理,既能达到最有效的杀伤肿瘤细胞作用,又对正常组织损伤较小。给药24h后,Chlorin e6在肿瘤及正常组织中含量均很少,72h后基本清除完毕,提示Chlorin e6具有代谢迅速、清除快的特点,可以有效减少对正常组织的毒副作用。第二部分Chlorin e6声动力对小鼠S180肉瘤生长的作用目的研究Chlorin e6联合超声对S180肉瘤的杀伤作用,探索理想的声动力治疗模式。方法1、单独超声照射对S180肉瘤生长的作用S180肉瘤荷瘤小鼠随机分为4组,每组5只小鼠：(1)对照组；(2)单独超声(声强0.4W/cm2)组；(3)单独超声(声强0.8W/cm2)组；(4)单独超声(声强1.6W/cm2)组。超声频率固定为1.0MHz,超声辐照时间固定为180s。2、单独Chlorin e6腹腔注射对S180肉瘤生长的作用S180肉瘤荷瘤小鼠随机分为4组,每组5只小鼠：(1)对照组；(2)单独Chlorin e6(剂量10mg/kg)组；(3)单独Chlorin e6(剂量20mg/kg)组；(4)单独Chlorin e6(剂量40mg/kg)组。3、Chlorin e6介导的声动力治疗对肿瘤的杀伤作用S180肉瘤荷瘤小鼠随机分为4组,每组5只小鼠：(1)对照组；(2)单独Chlorin e6(剂量40mg/kg)组；(3)单独超声(声强1.6W/cm2)组；(4)Chlorine6+超声组：40mg/kg Chlorin e6+1.6W/cm2超声；Chlorin e6腹腔注射后18h行超声处理,超声频率固定为1.0MHz,超声辐照时间固定为180s。4、Chlorin e6介导的声动力疗效与超声的强度关系S180肉瘤荷瘤小鼠随机分为4组,每组5只小鼠：(1)对照组；(2)40mg/kgChlorin e6+0.4W/cm2超声；(3)40mg/kg Chlorin e6+0.8W/cm2超声；(4)40mg/kg结论Chlorin e6具有肿瘤组织靶向性好、正常组织清除快的优点。Chlorin e6给药后18h是进行超声处理的理想时间点。Chlorin e6+1.6W/cm2超声。Chlorin e6腹腔注射后18h行超声处理,超声频率固定为1.0MHz,超声辐照时间固定为180s。5、Chlorin e6介导的声动力与Chlorin e6剂量的关系S180荷瘤小鼠随机分为4组,每组5只小鼠：(1)对照组；(2)1.6W/cm2超声+10mg/kg Chlorin e6;(3)1.6W/cm2超声+20mg/kg Chlorin e6;(4)1.6W/cm2超声+40mg/kg Chlorin e6。Chlorin e6腹腔注射后18h行超声处理,超声频率固定为1.0MHz,超声辐照时间固定为180s。每2d测量肿瘤大小,第15d剥离瘤体进行质量比较。实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析,组间两两比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、单独应用超声波或Chlorin e6对肿瘤生长的影响与对照组相比,单独使用声强为0.4-1.6W/cm2超声照射或单独注射Chlorin e6(剂量为10-40mg/kg)对肿瘤生长无显著影响(P>0.05)。提示在上述超声强度和Chlorin e6(?)(?)量范围内,单独应用超声或Chlorin e6均不能显著有效抑制肿瘤生长。2、Chlorin e6介导的声动力治疗对S180肉瘤的杀伤作用对照组肿瘤体积随时间逐步增长,单独使用1.6W/cm2超声和40mg/kg Chlorin e6对肿瘤生长无显著影响(P值分别为0.086、0.080),1.6W/cm2超声联合40mg/kg Chlorin e6声动力作用后肿瘤生长显著受抑制(t=30.509,P=-0.000)。提示Chlorin e6联合超声的声动力治疗具显著的协同抗肿瘤作用。3、Chlorin e6介导的声动力疗效与超声的强度关系与对照组相比,超声+声敏剂Chlorin e6联合治疗(Chlorin e6剂量固定为40mg/kg；超声强度分别设为0.4W/cm2、0.8W/cm2、1.6W/cm2)的3组对S180肉瘤生长产生显著抑制作用(P值分别为0.000、0.000、0.000)。而且在固定Chlorin e6剂量为40mg/kg情况下,超声强度越强,其抑瘤作用越明显,呈强度依赖性,1.6W/cm2强度的超声抑瘤性最强,提示1.6W/cm2可能为声动力治疗的最佳超声强度。4、Chlorin e6介导的声动力疗效与Chlorin e6剂量的关系与对照组相比,超声+声敏剂Chlorin e6联合治疗(固定超声强度为1.6W/cm2; Chlorin e6剂量分别设为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)的3组均对S180肉瘤生长产生显著抑制作用(P值分别为0.000、0.000、0.000)。在Chlorine e6剂量为10～40mg/kg范围内,肿瘤的抑制作用随Chlorine e6剂量的增加而增强,呈剂量依赖性,在固定频率1.0MHz,声强1.6W/cm2的超声条件下,40mg/kg Chlorin e6抑瘤性最强,提示该剂量的Chlorin e6可能为声动力治疗的最佳剂量。结论单独使用超声照射(0.4～1.6W/cm2)或单独注射Chlorin e6(10～40mg/kg)对小鼠S180肉瘤无显著杀伤作用。Chlorin e6联合超声可显著抑制肿瘤生长,抑瘤率随超声强度(0.4～1.6W/cm2)和Chlorin e6剂量(10～40mg/kg)的增加而增强,且未见光照性皮炎等毒副反应。