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第一部分TCDD诱导C57BL/6J胎鼠腭裂的最适剂量再探讨目的:观察不同剂量环境污染物2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导的C57BL/6J胎鼠腭部发育情况及死胎发生,探讨腭裂发生率和死胎发生率与TCDD剂量的相关性。方法:于合笼交配后第10.5天(GD10.5),将判断受孕并称重的C57BL/6J孕鼠分为不同剂量给药组给予0、8、18、28μg/kg的TCDD。观察孕鼠活动情况至GD17.5,处死孕鼠,剖腹取胎,观察死胎发生情况。于解剖显微镜下观察存活胚胎腭部发育情况。结果:对照组与实验组在孕鼠体重增加、每窝胚胎数上无差异(P<0.05),各剂量组产生的腭裂表型无差异。对照组无腭裂及死胎发生。各剂量组腭裂发生率均显著高于对照组(P<0.01);但TCDD18μg/kg和28μg/kg组间腭裂发生率无统计学差异(P>0.05);仅TCDD28μg/kg组与更低剂量组及对照组的死胎发生率存在差异(P<0.05)。结论:TCDD20μg/kg~30μg/kg剂量区间是诱导腭裂高发生率的平台区间,即为诱导C57BL/6J胎鼠腭裂高发生率的最适剂量。第二部分腭发育过程中基因组DNA甲基化的初步研究目的:研究TCDD作用于C57BL/6J孕鼠后,胎鼠腭组织基因组DNA甲基化水平变化及正向调控甲基化水平的DNA甲基转移酶(DNA methyltranferases,Dnmts)和负向调控甲基化水平的十-十一转位蛋白(Ten-Eleven Translocations,TETs)m RNA的表达情况,明确基因组DNA甲基化在腭发育过程中的作用。方法:C57BL/6J孕鼠共40只,随机分为TCDD组和对照组,每组20只。TCDD组于受孕后第10.5天(gestation day,GD10.5)以TCDD28μg/kg一次性灌胃;对照组以等量玉米油一次性灌胃;分别于GD13.5、GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5处死孕鼠,收集各时间点的胎鼠腭组织,分别提取基因组DNA、总RNA。应用MethylampT.M.基因组DNA甲基化定量试剂盒检测基因组DNA甲基化水平,实时荧光定量PCR检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b以及TET1、TET2、TET3 m RNA的表达量。结果:TCDD组标准化甲基化率在GD13.5显著高于对照组组(P<0.01);而在GD14.5、16.5均低于对照组(P<0.05,P<0.05)。在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt1 m RNA表达量高于对照组(P<0.05,P<0.01)。在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt3a m RNA表达量高于对照组(P<0.05,P<0.05)。在GD14.5,TCDD组Dnmt3b m RNA表达量显著高于对照组(P<0.01)。在GD13.5,TCDD组TET3 m RNA表达量显著低于对照组(P<0.01)。结论:胎鼠腭组织内可能存在复杂的DNA甲基化调控机制。由Dnmt1、Dnmt3a表达升高以及TET3表达降低引起的腭组织GD13.5基因组DNA甲基化水平的显著升高可能是TCDD致胎鼠腭发育障碍的表观遗传机制之一。第三部分TGF-β3、Dnmt1、Dnmt3a基因启动子区Cp G岛甲基化状态的实验研究目的:探讨TGF-β3、Dnmts基因启动子Cp G岛甲基化状态与TCDD所致胎鼠腭发育障碍的相关性。方法:将已知孕期的C57BL/6J孕鼠共18只,随机分为TCDD组和对照组。TCDD组于GD10.5给予28μg/kg的TCDD,对照组给予等体重体积的玉米油。分别于GD13.5、14.5、15.5处死孕鼠,收集各组胎鼠腭突组织。通过试剂盒提取组织DNA、亚硫酸氢盐转化、甲基化特异性PCR,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析各组各时间点腭组织表达的TGF-β3、Dnmts启动子Cp G岛甲基化状态。结果:各组各时间点TGF-β3启动子区Cp G岛均处于低甲基化水平,相同时间点两组间无统计学差异(P>0.05)。Dnmt1启动子区Cp G岛均处于高甲基化水平,相同时间点两组间亦无统计学差异(P>0.05)。TCDD组Dnmt3a启动子区Cp G岛1的甲基化水平在GD13.5和GD15.5高于对照组(P<0.01,P<0.01),在GD14.5低于对照组(P<0.01)。对照组Dnmt3a启动子区Cp G岛2的甲基化水平在各时间点均高于TCDD组(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。结论:TCDD诱导的胎鼠腭发育期间Dnmt3a启动子区接近第一外显子处Cp G岛低甲基化水平可能是Dnmt3a基因在GD13.5高表达的原因,并因此形成异常的基因组高甲基化状态,进而诱发胎鼠腭裂。