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目的:人工合成hsa-miR-200a mimics、inhibitor，分别转染HEC-1B细胞；采用MTT法、流式细胞技术检测上调及抑制miR-200a的表达对HEC-1B细胞增殖活性与凋亡的影响；运用生物信息学分析hsa-miR-200a指向的与增殖和凋亡相关的靶基因；Western blot、FQ-PCR检测转染前后靶蛋白及其mRNA的表达水平；EGFP荧光报告载体分析证明hsa-miR-200a靶向PTEN。探讨hsa-miR-200a对人子宫内膜腺癌HEC-1B细胞增殖与凋亡影响及其作用机制，为子宫内膜癌的诊断和治疗奠定基础。方法:1.细胞培养和转染人子宫内膜腺癌细胞HEC-1B细胞用DMEM/F12培养基+10%胎牛血清，于37℃、5%CO2培养箱中培养。接种5000个细胞/孔于96孔板中，次日配制miR-200a mimics-lipo2000混合液（终浓度20nM）、miR-200a inhibitor-lipo2000混合液（终浓度100nM）及其阴性对照，室温孵育20分钟加入细胞中，分别培养24、48、72、96小时后收获。2. mRNA和miRNA表达的FQ-PCR分析用Trizol Reagent抽提子宫内膜或转染48小时后细胞总RNA,逆转录成cDNA，用SYBR green PCR混合物完成实时定量PCR反应，采用U6作为内参，进行归一化。3. MTT法HEC-1B细胞接种于96孔板中，次日转染miR-200amimics、inhibitor及其阴性对照，分别于转染后24h、48h、72h、96h加入MTT（20μl）和DMSO（150μl），酶联免疫检测仪570nm波长处测定各孔光吸收值。实验重复3次，计算均值。4.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡取对数生长期细胞，转染48h后，PBS润洗，分别置70%冰乙醇或PBS中制备浓度106/ml单细胞悬液，应用流式细胞技术分析各组细胞周期时相分布或凋亡比例。实验重复3次，计算均值。5.生物信息学分析对Pictar、MirGen、Targetscan三个预测miRNAs靶标的数据库进行比对，找出交集，并用GO（Gene Ontology）数据库进行基因功能分析，筛选出与增殖或凋亡相关的基因作为研究对象。6. Western Blotting细胞裂解液抽提细胞总蛋白，10%SDS-PAGE分离蛋白，转至PVDF膜，与PTEN、Son、Pdcd4抗体(1:50)4℃过夜，次日与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:500）结合1小时，ECL法显色。7. EGFP荧光报告载体分析将构建的MU-pcDNA3/EGFP/PTEN, pcDNA3/EGFP/PTEN，pcDNA3.1（+）, pcDNA3.1/pri-miR-200a分别转染HEC-1B细胞，48h后检测荧光值。这项工作由SAIER BIOTHCHNOLOGY INC完成。8.统计学分析采用SPSS17.0统计软件分析数据，计量资料采用t检验，数据用均数±标准差表示，P≤0.05为差异显著有统计学意义。结果:1. miR-200a的表达miR-200a在人子宫内膜癌细胞株HEC-1B中存在表达。2.转染各组miR-200a的表达量转染模拟物组中miR-200a表达与对照组相比显著升高，而抑制剂组则显著降低(P＜0.05)，对照组与未处理组无明显变化。3. miR-200a表达对细胞增殖活性的影响MTT法检测发现转染miR-200a inhibitor组的HEC-1B细胞的增殖活性较正常组及阴性对照组明显降低；而转染mimics组的HEC-1B细胞增殖活性无显著变化(P＞0.05)。4. miR-200a表达对细胞周期影响流式细胞分析技术检测细胞周期，发现转染48h后，inhibitor组中G1期细胞数占总细胞数的比例明显高于空白组和阴性对照组，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。而转染mimics组的HEC-1B细胞周期无显著变化(P＞0.05)。5. miR-200a表达对细胞凋亡影响流式细胞分析技术检测细胞凋亡，发现转染48h后inhibitor组中凋亡细胞数占总细胞数的比例明显高于空白组和阴性对照组，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。而转染mimics组的HEC-1B细胞凋亡无显著变化(P＞0.05)。6.miR-200a的靶基因预测运用生物信息学技术，通过数据库预测得到Son、Pdcd4、Pten等为miR-200a调控的靶基因。7.miR-200a负性调控PTEN转染前后HEC-1B细胞中蛋白Son、Pdcd4的表达量没有明显改变，仅蛋白PTEN的表达发生改变,即模拟物组中表达量下调，而抑制剂组中PTEN的表达量是上调的。转染前后细胞中PTEN mRNA水平没有显著变化(P＞0.05)。8.miR-200a靶向PTEN mRNA3’非翻译区EGFP荧光报告载体分析pcDNA3/EGFP/PTEN+pri-200a组绿色荧光表达最低，与对照相比有明显差异（*p<0.05），而MU-pcDNA3/EGFP/PTEN中EGFP表达无显著影响。结论:1.抑制hsa-miR-200a的表达可影响HEC-1B细胞的增殖与凋亡。2.在HEC-1B细胞中，hsa-miR-200a通过调节PTEN蛋白表达水平从而影响HEC-1B细胞的增殖与凋亡。