论文部分内容阅读
实验目的:成牙本质细胞在感染及炎症中的存活能力很大程度上决定着牙髓炎的预后。整合素相关蛋白(Integrin associated proteins,IAP or CD47)是活细胞表面广泛表达的“自我识别分子”,且与细胞自噬及凋亡密切相关。本研究利用人炎症牙髓组织和体外经脂多糖(lipopolysaccharide)处理的小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T),探讨了炎症刺激影响下CD47分子表达变化以及与自噬和细胞凋亡之间的关系。实验方法:①临床收集人牙髓标本,根据其牙髓损伤状况分为健康组、龋病组和牙髓炎组,分别提取牙髓组织蛋白或制备组织切片备用;②利用免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)定位不同组牙髓组织中炎症因子,自噬标志分子及细胞凋亡指标表达部位;③利用免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)共定位各组牙髓组织中CD47分子表达与自噬标签蛋白LC3;④免疫印迹实验(Western blotting,WB)检测不同组牙髓组织中CD47分子表达水平炎症水平,炎症水平,自噬水平以及细胞凋亡水平的变化;⑤体外实验中,利用1μg/mlLPS处理mDPC6T细胞,分别检测6小时、12小时、18小时、24小时后CD47、自噬相关蛋白及细胞凋亡的表达变化;⑥进一步利用小RNA干扰技术敲低CD47表达,检测并比较各组间自噬相关蛋白及细胞凋亡的变化差异;⑦利用生物信息学技术寻找CD47分子胞内信号通路关键蛋白,利用IHC及IF技术初步探究人牙髓标本中关键蛋白分子、CD47配体分子SIRPα分子的表达,以及巨噬细胞的聚集水平。实验结果:①在牙髓组织炎症进展过程中,炎症因子,自噬相关蛋白以及细胞凋亡指标的表达主要定位于成牙本质细胞层;②免疫印迹实验结果显示:牙髓标本中炎症水平的升高的同时,CD47分子表达水平的显著下降,且自噬增强、凋亡水平升高;③CD47与LC3在龋病组和牙髓炎组成牙本质细胞层存在显著共表达;④在经LPS处理的mDPC6T细胞系中,CD47分子的减少伴随自噬的持续激活以及细胞凋亡的增加;⑤CD47特异性敲低后,细胞自噬和凋亡增加;⑥生物信息学分析发现TRAF6为CD47胞内信号转导可能的关键分子,IHC和IF结果显示TRAF6表达水平与炎症水平呈正相关,且SIRPα表达水平以及巨噬细胞聚集水平也与炎症水平正相关。实验结论:炎症微环境下成牙本质细胞自噬及凋亡水平均升高;随着炎症损伤的加剧,“自我识别分子”CD47表达的持续降低与成牙本质细胞自噬及凋亡水平的增加有关。