铁是人体必需的微量元素之一。适宜浓度的铁在机体内发挥重要的生理作用,包括参与氧的输送和转运、能量代谢、蛋白质的合成等。但是,铁过载则可激活氧化应激,诱发线粒体铁积累、神经元铁代谢紊乱和细胞凋亡等。流行病学研究提示脑铁过量沉积与神经退行性疾病有关联性,包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多发性硬化症等。毒理学研究表明,铁过载可致NMRI小鼠的认知功能受损,并可加重AD模型小鼠(淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)/早老素1(presenilin 1,PS1)小鼠和Tg2576小鼠)的认知功能损害。然而,研究报道铁螯合剂去铁胺(deferoxamine,DFO)不仅对AD模型动物有神经保护作用,而且对AD患者也显现出积极的治疗作用。但是,迄今有关铁的神经毒性的作用机制仍不清楚。基于此,本研究开展了以下三部分研究:首先构建铁长期暴露C57/BL6小鼠模型,用多种行为学实验评价其认知功能,并用多组学技术研究铁长期暴露对C57/BL6小鼠血清代谢谱和肠道微生物谱以及海马组织的蛋白质表达谱的影响。随后,构建不同剂量铁长期处理APP/PS1小鼠模型。为明确经鼻DFO给药对小鼠神经功能的保护作用,构建了高铁(10 mg/L)与DFO长期处理APP/PS1小鼠模型,进行了实验小鼠的认知功能的评估和小鼠海马组织β-淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)沉积和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达以及海马组织的蛋白质差异表达谱分析,并用Western Blot进一步验证了蛋白质组学结果。最后,在一个城市社区老年人群中探索性研究了尿铁浓度与其认知功能障碍的剂量―反应关系。第一部分多组学研究铁长期暴露致小鼠认知功能损伤的作用机制目的:研究铁长期暴露对C57/BL6小鼠认知功能的影响及作用机制。方法:将30只3月龄雄性C57/BL6小鼠随机分为对照组和铁处理组(15只/组)。对照组给予标准啮齿类动物饲料和饮用水,铁处理组给予标准啮齿类动物饲料及含铁(10 mg/L)饮用水,连续处理实验小鼠6个月。为评价其认知功能、情绪状态和运动协调性,在实验小鼠9月龄时进行新物体识别实验、电跳台实验、水迷宫实验、明暗箱实验、旷场实验和转棒实验。用HE染色诊断实验小鼠海马组织的病理形态学变化。用相关试剂盒测定小鼠海马组织ATP含量。用液相色谱―串联质谱仪(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测小鼠血清代谢谱和海马组织的蛋白质表达谱。用Western Blot技术进一步分析了小鼠海马组织涉及突触囊泡循环通路、突触前膜和突触后膜的16个相关蛋白质,以及神经元线粒体电子传递链复合体和线粒体动力学蛋白质共9个蛋白质的表达水平。用Illumina高通量测序技术分析小鼠的肠道微生物谱。结果:新物体识别实验、电跳台实验、水迷宫实验结果一致性表明:铁处理可致C57/BL6小鼠认知功能障碍。铁处理组C57/BL6小鼠海马组织DG区神经元结构异常,出现神经元核浓染病理变化。与对照组相比,铁处理组C57/BL6小鼠海马组织ATP水平降低24%(P<0.05)。两组C57/BL6小鼠的海马组织共检出主要与谷氨酸能突触和突触囊泡循环通路等相关的66个差异表达蛋白质。Western Blot结果表明,与对照组相比,铁处理组C57/BL6小鼠海马组织的突触小体相关蛋白25(synaptosomal-associated protein 25,SNAP25)、囊泡相关膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein 2,VAMP2)、SynapsinⅠ、GluA2(AMPA Receptor 2)、NMDAR2A(N-methyl-D-aspartate receptor-2A)、ATP5H(ATP synthase subunit d)表达下调,动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,DRP1)表达上调(all P<0.05)。此外,在两组C57/BL6小鼠血清中检出富集在脂代谢、氨基酸代谢等通路的40个差异性代谢物。PCoA(principal coordinates analysis)分析和NMDS(nonmetric multidimensional scaling)分析显示两组C57/BL6小鼠肠道菌群构成有差异性。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能注释揭示在两组C57/BL6小鼠显现出与糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、神经系统、神经退行性疾病等相关的69条代谢通路的差异性。结论:用10 mg/L铁处理C57/BL6小鼠6个月对其血清中脂类、氨基酸类代谢谱和肠道微生物谱有影响,检出C57/BL6小鼠海马组织的病理形态学改变以及突触和线粒体功能相关蛋白表达变化,并与其认知功能损伤可能存在相关性。第二部分去铁胺对铁长期暴露诱导APP/PS1小鼠认知功能障碍的改善作用目的:研究不同剂量铁长期处理对APP/PS1小鼠认知功能的影响以及DFO对高剂量(10 mg/L)铁诱导APP/PS1小鼠认知功能障碍的改善作用。方法:将50只3月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为对照组(饮用水)、低铁组(0.1 mg/L饮用水)、高铁组(10 mg/L饮用水)、高铁+DFO组(10 mg/L饮用水+DFO经鼻给药(24μL/次/只,终浓度:100 mg/mL,3次/周))、DFO组(饮用水+DFO经鼻给药(24μL/次/只,终浓度:100 mg/mL,3次/周)),每组10只小鼠,连续处理6个月。所有实验组小鼠均用标准啮齿类动物饲料喂养。在实验小鼠9月龄时实施新物体识别实验和水迷宫实验旨在评价其认知功能。分别用免疫组化和免疫荧光方法检测小鼠海马区Aβ沉积和GFAP表达水平。用液相色谱―串联质谱仪(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析小鼠海马区蛋白质差异表达谱。用Western Blot方法分析小鼠海马组织的突触前、突触后、线粒体电子传递链复合体Ⅰ-Ⅴ的部分亚基、线粒体动力学、APP加工过程、磷酸化Tau蛋白等37个蛋白表达水平。结果:与对照组相比,新物体识别实验和水迷宫实验均提示高铁组APP/PS1小鼠的认知功能损伤加重。水迷宫实验表明DFO经鼻给药可改善APP/PS1小鼠的认知功能,对高铁诱导小鼠认知功能损伤有逆转作用。与对照组相比,高铁组APP/PS1小鼠海马区Aβ沉积增多,但DFO组小鼠海马区Aβ沉积却减少。与对照组相比,高铁组小鼠脑内活化的星形胶质细胞数量增多,但DFO组则减少。与高铁组相比,高铁+DFO组APP/PS1小鼠的脑内活化的星形胶质细胞数量相应减少(all P<0.05)。在低铁组和对照组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质50个。但在高铁组和对照组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质11个。在DFO组和对照组小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质62个。在高铁组和高铁+DFO组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质52个。Western Blot结果显示:与对照组相比,高铁组APP/PS1小鼠的海马区Syntaxin 1a、NMDAR2A(N-methyl-D-aspartate receptor-2A)、NMDAR2B(N-methyl-D-aspartate receptor-2B)蛋白表达下调;DFO组APP/PS1小鼠的海马区Syntaxin 1a、SynapsinⅠ蛋白表达上调(all P<0.05)。与高铁组相比,高铁+DFO组APP/PS1小鼠的海马区CPLX1(complexin-1)、CPLX2(complexin-2)、Syntaxin 1a蛋白表达上调(all P<0.05)。结论:高铁(10 mg/L)长期暴露加重了APP/PS1小鼠的认知功能损伤和脑内Aβ斑块沉积,并上调GFAP表达水平。但DFO则下调了APP/PS1小鼠脑内GFAP表达水平,并对高铁诱导APP/PS1小鼠的认知功能损伤有改善作用,且伴有海马区突触、线粒体功能相关差异表达蛋白质,由此提示一定剂量DFO(100 mg/mL)对10 mg/L铁诱发APP/PS1小鼠的神经毒性可能有改善作用。第三部分老年人群尿铁浓度与认知功能障碍风险的剂量―反应关系目的:在社区老年人群中探索性研究尿铁浓度与认知功能障碍的剂量―反应关系。方法:在2017年7月20日至2018年10月10日期间,采用分层整群抽样方法招募长期居住深圳市某区的≥60岁社康居民共9411人为研究对象,对其进行健康问卷调查和健康体检,同时采用简易智力状态评估量表(Mini-cog)评价其认知状况,并在其体检日收集研究对象的空腹静脉血和早晨点尿样。血常规和血生化项目均在该区某医院及时完成。用电感耦合等离子体质谱仪检测研究对象尿金属浓度,并用肌酐测定试剂盒测定其尿肌酐浓度。在9411名研究对象中,有7706人提供了满足尿肌酐和金属浓度测定的尿样。在7706人中,有7185人完成了认知功能的评价。当排除癫痫、中风、AD、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、抑郁症、颅内肿瘤患者后,最终7073人纳入本部分研究。为解析尿铁浓度与认知功能障碍的关联性,首先采用多因素非条件logistic回归分析,随后利用限制性立方样条(restricted cubic spline,RCS)分析尿铁浓度与认知功能障碍之间是否存在剂量―反应关系。结果:非条件logistic回归分析提示:在7073人中,当校正尿铜、锌、锰、硒、铝、铅、镉、砷的log转换值后,尿铁log转换值每增加一个单位,其认知功能受损风险增加1.471倍。限制性立方样条(restricted cubic spline,RCS)分析显示:尿铁浓度与认知功能障碍呈线性相关性(非线性检验χ~2=0.76,P>0.05)。结论:在本研究人群中,尿铁浓度与认知功能障碍呈现线性剂量―反应关系。