EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是一种DNA致瘤病毒，是一种与多种肿瘤发生发展密切相关的外部致病因子，研究表明，EBV在多种肿瘤细胞中存在并且与这些肿瘤的发生发展密切相关，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、T细胞性淋巴瘤、何杰金病、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等。EB病毒致瘤谱的扩大以及越来越多的关于EBV在相关肿瘤的病因发病学上的证据，使得人们对EBV的关注越来越多。 EBV感染靶细胞的方式主要有潜伏性感染和裂解性感染两种状态。先前的研究证实，EB病毒的潜伏状态与多种肿瘤的发生相关，而裂解复制则能诱导细胞死亡，并且我们实验室以及国内外的其他实验室利用诱导EB病毒裂解复制，进行EB病毒阳性肿瘤的实验研究。结果表明该策略具有较好的EB病毒阳性肿瘤细胞杀伤作用。 最新的研究表明，EB病毒裂解复制状态亦与肿瘤的发生发展相关。在EBV相关疾病患者中可以检测到EBV裂解复制基因的转录本、蛋白或相应抗体。针对EBV裂解复制抗原的抗体滴度的增加以及血清中EBV DNA拷贝数的增加，这两个代表体内EBV裂解活化的参数，与肿瘤的进展分期、预后差以及易复发转移密切相关。 大量的实验以及我们前期的工作均证实，在鼻咽癌患者血清中有游离EB病毒基因组存在，而在正常对照组中则无EBV基因组存在。此外，有文献证实多种EBV相关的肿瘤中发生了EBv裂解复制。尽管BZLF1蛋白是EB病毒编码的刻早基因的主要产物，可以启动病毒的裂解复制周期，最终导致细胞死亡，但有研究表明，BZLF1蛋白的表达并不总是导致病毒颗粒的产生以及导致肿瘤细胞死亡，这种流产式的裂解感染(abortive lytic infection)不仅在NPC中观察的到，同样在Hodgkins病、免疫缺陷的non-Hodgkins淋巴瘤以及EB病毒相关的胃癌中存在。 上述研究打破了传统的EB病毒仅在潜伏感染状态产生细胞转化的观点，拓宽了对EB病毒致病机理的认识，病毒发生裂解复制的意义可能是使感染的宿主细胞或邻近细胞发生转化，或改变细胞的生物学特性，使肿瘤的恶性程度增加，易于转移。这提示我们，如果抑制EB病毒裂解复制蛋白水平是否可能从另一个角度逆转病毒感染的细胞的恶性转化的潜能。 肿瘤的化学预防是用化学药物预防肿瘤的发生或使肿瘤分化逆转，化学干预是肿瘤化学预防研究的重要手段，随着肿瘤流行病学的深入研究和对肿瘤发生机制的进一步探讨，发现不少食物来源的化合物和食物微量成分可影响肿瘤的发生与发展，对肿瘤的化学预防研究起到了积极的推动作用。 茶叶富含多酚类化合物，茶多酚类化合物包括黄烷醇，黄酮类和茶多酚酸类，其中大部分为黄烷醇，通称儿茶素，主要的绿茶儿茶素有：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，表没食子酸酯(ECG)，表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)等，其中EGCG含量最高，占儿茶素的80％。 近年来，利用肿瘤体内外模型寻求自然来源的化合物对肿瘤异常激活的信号转导通路的干预，研究其在重要信号通路中对关键蛋白作用机制己成为一个快速发展的领域。 我们采用Western Blotting、荧光定量PCR方法，确定了在B淋巴细胞B95.8和鼻咽癌细胞系CNEl、CNEl一LMP1中存在有EBNAl、LMP1、BZLF1基因产物，并存在EB病毒自发性的裂解复制。证明在所用细胞中EB病毒以裂解、潜伏两种方式共存。 EB病毒一旦活化，EB病毒裂解周期两个刻早基因BZLF1和BRLF1表达，反式活化病毒及某些细胞的启动子从而导致病毒基因的有序表达级联反应的发生。活化早期基因表达后，紧接着裂解周期级联反应中病毒基因组复制，随后晚期基因表达。EB病毒的裂解复制周期处于严密的调控下，其间病毒的活化涉及多条细胞信号通路的参与，并且需要一定的细胞微环境。 目前，大量研究表明/MAPK(ERK1/2、p38、JNK)信号通路在EB病毒活化进入裂解复制中起重要作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的一类重要的信号纽带。激活的MAPK可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白、酶类等多种底物来调节细胞增殖、分化、转化及凋亡等生物学行为。在研究EB病毒裂解复制过程中发现，细胞内另一重要的信号通路PI3-K/Akt在EB病毒活化中也扮演着重要角色。PI3-K/Akt信号通路通过磷酸化多种底物，促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成，抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡，正因其与肿瘤发生发展的相关性，近年来备受瞩目。 目前已有文献报道，EB病毒编码的LMP1在EB病毒的感染周期中起着重要的作用。国内外大量的研究表明，EB病毒可能利用其编码的LMP1以达到双重目的。一方面LMP1可以为EB病毒DNA的有效复制创造合适的环境，通过促进细胞增殖或通过触发一些必要的信号通路。而一旦病毒裂解复制周期程序启动，强烈诱导LMP1表达可以保证病毒得以有效地从细胞中释放并感染新的宿主细胞，保证了病毒能够长久存在。另一方面，LMP1负性调节病毒的裂解复制，异常表达的LMP1可以抑制病毒的裂解复制。所以EB病毒通过一系列复杂的策略使其既可以终生存在于宿主，同时又可以产生具有感染能力的病毒颗粒维持病毒的传播。我们实验室以及国内外对LMP1在细胞信号转导通路中的作用进行的大量研究证明LMP1可以活化ERK/MAPK、p38/MAPK、JNK/MAPK、PI3-K/Akt等多条细胞内信号通路，并且促进细胞周期行进，S期细胞增加。 目前在EGCG调节信号通路不同关键蛋白的效应的研究过程中发现，蛋白质与EGCG的直接结合是EGCG发挥作用的关键步骤。鉴定与EGCG直接结合的蛋白是阐明EGCG产生效应的关键。目前已经鉴定出多种与EGCG直接结合的蛋白，包括fibronectin、fibrinogen，histidine-richglycoprotein，laminin，Fas、MMP-2，9、Bcl-2、Insulin-Like Growth Factor-I Receptor、GRP-78、vimentin等。 根据以上研究进展，我们采用信号转导通路中特异性的小分子抑制剂，明确了参与EB病毒裂解复制过程中由LMP1异常激活的MAPK(ERK，JNK，p38)、PI3-K/Akt两大类信号转导通路。不同浓度EGCG处理细胞，在剂量依赖性的下调EB病毒自发性的裂解复制蛋白水平的同时，显著地阻断了LMP1调的上述信号通路。并且EGCG能够与MAPK和PI3K/AKT信号通路下游的关键的转录因子p53、p65、Ets1结合。表明MAPK、PI3-K/Akt信号通路参与了EGCG对EB病毒裂解复制蛋白的下调，并且在来源不同的细胞中参与EB病毒裂解复制的信号通路也不尽相同。 随后我们采用脱氧核酶抑制LMP1表达的阻断策略以及瞬时转染LMP1表达质粒的诱导策略，利用Western Blotting等技术，确定LMP1促进EB病毒裂解复制，从一个新的角度提示LMP1调控EB病毒在鼻咽癌发生发展过程中的重要作用。EGCG能够从转录水平以及蛋白是水平下调LMP1表达，另一方面EGCG能够与LMP1蛋白质直接结合，从而通过LMP1抑制EB病毒裂解复制。 通过细胞蛋白裂解液与EGCG-Sepharose 4B的pull-down分析发现，EGCG与AP-1的Jun组分c-Jun、JunB蛋白直接结合，进而报道基因分析法发现EGCG呈剂量依赖性的抑制BZLF1基因启动子活性。体外建立含不同浓度EGCG的PCR反应体系发现，EGCG抑制DNA聚合酶Taq酶活性，影响PCR产物的合成，并且real-time PCR检测EB病毒W片段发现EGCG影响了细胞内EB病毒DNA的复制。 通过本课题的研究，我们对于EGCG抗病毒以及抗EB病毒自发性裂解复制的分子机制有了新的科学发现，所获得的原创性的发现加深了我们对于EGCG抗EB病毒自发性裂解复制这一现象的理解。由于EGCG具有抗病毒的能力，而其他疱疹病毒的生活周期与EB病毒类似，因此EGCG可能通过类似的分子机制抑制其他类的疱疹病毒的生活周期，这从另外一个角度阐明了EBV-LMP1在EB病毒相关肿瘤中的发病机理，并且为EGCG抗病毒能力的分子机制提供了新的启示与思考。