谷氨酸棒杆菌中苯甲酸转运蛋白研究

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sanrenET
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谷氨酸棒杆菌是对革兰氏阳性菌进行遗传和生理研究的模式生物。谷氨酸棒杆菌中芳香酸代谢也有深入广泛的研究报道。对一些芳香化合物来说,通过转运蛋白的作用跨膜进入细胞,是其降解过程的第一步,但对于芳香酸转运蛋白转运机理的研究报道较少。已有报道从谷氨酸棒杆菌基因组中鉴定出了一系列编码芳香酸转运蛋白的基因,其中,ncgl2325和ncgl2326被证明与苯甲酸的吸收有关。   本研究首先将谷氨酸棒杆菌中芳香酸转运蛋白与绿色荧光蛋白融合,以研究其在细胞内的定位。将融合蛋白分别在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达,发现转运蛋白在细胞内都是与膜相关的。同时以14C标记的苯甲酸为底物,研究NCg12325和NCg12326转运底物时的动力学性质。结果表明,NCgl2325作为芳香酸/H+同向转运蛋白家族的典型成员,其转运苯甲酸的Vmax是0.19±0.01nmolmin1mg-1ofdryweight,Km值是1.11±0.24μmol1-1。用苯甲酸的的结构类似物进行底物抑制实验,发现羟基取代的苯甲酸对底物转运有明显的抑制作用(>50%)。在NCg12325中选择了七个位点进行定点突变以研究其结构和功能的关系。结果表明,无论是亲水区的保守位点(Gly-80,Asp-84和Asp-312),还是跨膜疏水区的极性位点(Asp-35,Arg-119,Glu-139和Arg-386)突变后,NCg12325都失去了转运苯甲酸的能力。研究还发现,野生型NCgl2325和突变株D84N可以吸附龙胆酸和3-羟基苯甲酸,但这种结合并不稳定。其他各株突变株对这两种化合物没有任何作用。本研究未能通过[14C]苯甲酸转运实验测到NCg12326转运苯甲酸的活力,而基因ncgl2325和ncgl2326双敲除的细胞通过诱导仍然可以转运、积累和利用苯甲酸生长,说明谷氨酸棒杆菌中存在另外的苯甲酸转运系统。本研究利用同位素标记的底物对谷氨酸棒杆菌中苯甲酸转运蛋白进行了系统研究。这是首次对来自于高GC含量的革兰氏阳性菌中的芳香酸转运蛋白进行转运机理研究,也是第一次对苯甲酸转运蛋白的分子机理进行探讨。这将丰富对芳香酸转运蛋白工作机理的认识。另外,本文还对Pseudomonas sp. WBC-3中的对苯二酚双加氧酶的功能进行了初步鉴定。在WBC-3菌株中,对硝基酚的代谢是通过对苯二酚开环生成4-羟基粘糠酸半醛的途径进行的,这步反应是由pnpCD编码的对苯二酚双加氧酶(HQDO)催化的。对苯二酚双加氧酶是一个异源多聚体,在体外可以催化对苯二酚开环。这为研究其后续的两个新的基因,4-羟基粘糠酸半醛脱氢酶基因(pnpE)和马来酰乙酸还原酶基因(pnpF),并进而深入研究WBC-3中对硝基酚代谢机理奠定了基础。
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