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手足口病(Hand foot and mouth disease HFMD)是一种由肠道病毒引起的儿童传染病,又名发疹性水疱性口腔炎,以手、足和口腔粘膜疱疹或者破溃后形成溃疡为主要临床症状。引起手足口病的肠道病毒有20多种,其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)最常见。近年来发现EV71是致死率最高、感染力最强的肠道病毒。EV713Cpro (EV713C蛋白酶)基本上参与了EV71病毒复制中所有蛋白的剪切,对EV71病毒的复制非常重要,另外,它还具有抑制宿主免疫系统、关闭宿主细胞蛋白合成体系、诱导宿主细胞程序性凋亡等功能,所以EV713Cpro被作为抗病毒的靶标,能够筛选到抑制EV713Cpro的活性的化合物对于治疗手足口病具有很重要的研究意义。本文通过转化、挑单菌落、37度摇菌、转接、低温诱导等一系列步骤进行EV713Cpro的原核表达；通过镍柱结合原理进行该蛋白酶的纯化；通过FRET(荧光共振能量转移)的原理,合成在两端加上荧光基团并且含有EV71多聚蛋白自切割位点3B-3C(有Q-G连接)的多肽(Dabcyl-RTATVQGPSLDFE-Edans)作为底物来建立EV713Cpro的测活平台；通过SPR(表面等离子共振)技术和虚拟筛选的方法从7164个小分子化合物中筛选与EV713C蛋白酶有结合的小分子,然后在建立的EV713Cpro测活平台上,以AG7088(Rupintrivir)为阳性抑制剂,验证所筛选到的化合物对该蛋白酶是否具有抑制活性,结果是通过SPR技术从7031个化合物筛选到3401个和EV713Cpro有结合的化合物,通过酶活平台验证后,有一个化合物(1478号化合物)有抑制效果,通过计算机辅助虚拟筛选的方法从SPECS库(共30646个小分子)中筛选到133个和EV713C蛋白酶有结合的化合物,其中83个是含α,β-不饱和双键化合物,通过酶活平台验证后,有5个有抑制效果的化合物(2,39,72,75,99号化合物),50个是不含α,p-不饱和双键化合物,筛选到一个对EV713C蛋白酶有抑制活性的化合物(90号化合物)；然后在RD细胞(恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞)水平,通过对感染了EV71C4病毒的RD细胞给药的方法测定分子水平筛选出的7个对EV713Cpro有抑制活性的小分子化合物的抗病毒效果,结果只有90号化合物具有一定的抗病毒效果；然后通过对有抗病毒活性小分子和EV713Cpro共结晶的方法可能从结构方面为抗病毒药物研发提供新的思路,同时通过对90号化合物进行改造旨在发现更高活性抗病毒抑制剂。对3C蛋白酶有广谱性抗病毒效果的AG7088结构中含有一个特殊的α,β-不饱和双键,从细胞水平实验发现含有这个不饱和双键的化合物通常毒性比较大,而90号化合物对细胞无毒的最高浓度高达180μM,抗病毒效果的ICso在150μM,而且它是不含这个α,β-不饱和双键的,所以它有可能对抗EV71病毒的药物研发提供新的源头。