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多杀菌素是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的次级代谢产物,兼有生物农药的安全性和化学合成农药的速效性,作用机理独特,对哺乳动物、昆虫天敌和环境安全。开发该产品具有很好的经济效益和社会效益。本文研究了刺糖多孢菌原生质体制备与再生的条件,通过原生质体诱变、刺糖多孢菌与阿维链霉菌科间原生质体融合、刺糖多孢菌种内原生质体融合选育多杀菌素高产菌株。主要研究结果如下:
1.通过考察不同条件对刺糖多孢菌原生质体制备和再生的影响,确定了菌体在添加0.3％甘氨酸的EHC培养基中培养72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,于R6再生培养基上再生,原生质体制备率超过99％,再生数达107cfu/mL。原生质体可置于4℃短期保存72h,长期保存需要放置于-80℃条件下。
2.通过原生质体紫外诱变获得遗传稳定的多杀菌素高产菌株1株,多杀菌素产量较出发菌株提高了近40％。
3.通过双亲灭活原生质体法筛选融合子。刺糖多孢菌NU-92采用紫外灭活,灭活时间为120s,刺糖多孢菌C3-10-4采用热灭活,灭活温度60℃,灭活时间为50min。阿维链霉菌76-02-e原生质体也采用相同温度进行热灭活,灭活时间30min。
4.通过电融合技术将阿维链霉菌与刺糖多孢菌进行原生质体融合,考察了排列电场以及脉冲电场条什对原生质体融合率的影响,最终确定了排列电压7V、持续时间50s、脉冲电压200V、脉冲时间40μs、脉冲次数2次时融合率最佳,但是融合子产素水平不高,未筛选到遗传稳定的高产菌株。刺糖多孢菌种内原生质体融合率要显著高于科间的原生质体融合,但是所获融合子产素水平未有提高。
5.利用PEG介导的化学融合方法进行刺糖多孢菌科间以及种内的原生质体融合。选用50％的PEG1000作为促融剂,融合时间为2-5min时融合率最高。但是阿维链霉菌与刺糖多孢菌科间原生质体融合负突变率高达94.7％,未筛选到高产菌株。刺糖多孢菌种内的原生质体融合正突变率达75％,获得多杀菌素高产菌株1株,多杀菌素产量较对照菌株提高了近200％,且遗传稳定性良好。