目的:探索Nedd4L基因对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响及意义。方法:1.质粒最佳作用浓度将不同浓度(50nmol/L、30nmol/L、10nmol/L、0nmol/L)带荧光的阴性质粒pEGFP-N1或FAM-Negative siRNA借由脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染入HSC-T6 24小时后,在倒置荧光显微镜下观察各浓度组的转染率即为带绿色荧光细胞占总细胞的比例,明确质粒最佳转染浓度。2.TGF-β1对HSC-T6中Nedd4L表达的影响首先用不同浓度TGF-β1(0 ng/ml、1 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml)刺激HSC-T624小时后,用RT-PCR方法检测Collagen-ⅠmRNA及Nedd4L mRNA的表达,以建立最佳体外肝纤维化模型;随后选取最佳浓度TGF-β1刺激HSC-T6 0小时、12小时、24小时、48小时后,同样用RT-PCR方法检测Collagen-ⅠmRNA及Nedd4L mRNA的表达,以明确TGF-β1对HSC-T6中Nedd4L表达的影响。3.Nedd4L基因过表达对HSC-T6中TGF-β1/Smad信号通路的影响将HSC-T6分为3组:空白对照组(TGF-β1+脂质体+等量无血清和抗生素的DMEM培养液);阴性质粒组(TGF-β1+脂质体+阴性质粒+DMEM培养液);Nedd4L过表达组(TGF-β1+脂质体+Nedd4L过表达质粒+DMEM培养液)。通过脂质体转染的方法,分别将上述质粒转染入HSC-T6 24小时后,采用RT-PCR及Western blot法检测细胞中Nedd4L、Smad3、p-Smad2/3、Collagen-ⅠmRNA及蛋白的表达。4.sirna抑制nedd4l基因表达对hsc-t6中tgf-β1/smad信号通路的影响将hsc-t6分为3组:空白对照组(tgf-β1+脂质体+等量无血清和抗生素的dmem培养液);阴性质粒组(tgf-β1+脂质体+fam-negativesirna+dmem培养液);nedd4lsirna干扰组(tgf-β1+脂质体++nedd4lsirna+dmem培养液)。通过脂质体转染方法,分别将上述质粒转染入hsc-t624小时后,采用rt-pcr及蛋白印迹法检测细胞中nedd4l、collagen-Ⅰ、smad3、p-smad2/3的mrna及蛋白的表达。结果:1.不同浓度阴性质粒转染hsc-t6转染率50、30、10nmol/l的阴性质粒pegfp-n1或fam-negativesirna转染hsc-t624小时后均可见绿色荧光,对照组未见荧光信号。50、30nmol/l组pegfp-n1或fam-negativesirna质粒转染效率均明显高于10nmol/l质粒(38%vs34%vs19%;33%vs35%vs23%),而50nmol/l组与30nmol/l组比较,质粒转染率差异均无统计学意义(p>0.05)。但50nmol/l组部分细胞漂浮,发生死亡。因此,pegfp-n1或fam-negativesirna最佳转染浓度30nmol/l。2.tgf-β1对hsc-t6中nedd4lmrna表达的影响(1)0ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/mltgf-β1刺激hsc-t624小时,collagen-Ⅰmrna相对表达量呈剂量依赖性上调,两两比较,除2.5ng/ml组与5ng/ml组差异无统计学意义外(p>0.05),其余均有统计学意义(p均<0.05);(2)2.5ng/mltgf-β1刺激hsc-t60小时、12小时、24小时、48小时后,collagen-Ⅰmrna相对表达量呈时间依赖性上调,两两比较,除24小时组与48小时组差异无统计学意义外(p均>0.05),其余均有统计学意义(p均<0.05);(3)不同浓度(1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml)tgf-β1刺激hsc-t624小时,nedd4lmrna相对表达量呈剂量依赖性下调,与0ng/ml组相比,差异均有统计学意义(p<0.05);(4)2.5ng/mltgf-β1刺激hsc-t612小时、24小时、48小时,nedd4lmrna相对表达量与0小时组相比,呈时间依赖性下调,差异均有统计学意义(p<0.05)。3.nedd4l过表达对hsc-t6中tgf-β1/smad信号通路的影响(1)rt-pcr及westernblot检测结果显示:nedd4l过表达组nedd4lmrna及蛋白表达均显著高于空白对照组(28.65±0.94vs1;0.69±0.06vs0.36±0.01),差异有统计学意义(p<0.05);阴性质粒组与空白对照组相比,nedd4lmrna及蛋白表达水平无显著差异(0.83±0.16vs1;0.38±0.03vs0.36±0.01);(2)rt-pcr及westernblot检测结果显示:nedd4l过表达组collagen-Ⅰmrna及蛋白表达均显著低于空白对照组(0.41±0.25vs1;0.35±0.16vs0.68±0.04),差异有统计学意义(p<0.05);阴性质粒组与空白对照组相比,collagen-Ⅰmrna及蛋白表达无显著差异(1.19±0.07vs1;0.71±0.02vs0.68±0.04);(3)westernblot检测结果显示:三组之间smad3蛋白表达(0.79±0.03、0.75±0.03、0.78±0.04)差异均无统计学意义(p>0.05);nedd4l过表达组p-smad2/3蛋白的相对表达量(0.17±0.08)显著低于空白对照组(0.28±0.04),差异均有统计学意义(p<0.05);而阴性质粒组与空白对照组相比,p-smad2/3蛋白的相对表达量无显著差异(0.27±0.01vs0.28±0.04)。4.sirna抑制nedd4l基因表达对hsc-t6中tgf-β1/smad信号通路的影响(1)rt-pcr及westernblot检测结果显示:sirna抑制nedd4l24小时后,nedd4lmrna及蛋白表达显著低于空白对照组(0.29±0.05vs1;0.25±0.05vs0.36±0.01),差异均有统计学意义(p<0.05);阴性质粒组与空白对照组相比,nedd4lmrna及蛋白表达无显著差异(0.83±0.16vs1;0.38±0.03vs0.36±0.01);(2)rt-pcr及westernblot检测结果显示:sirna抑制nedd4l24小时后,collagen-Ⅰmrna及蛋白表达显著高于空白对照组(3.32±0.39vs1;1.39±0.07vs0.68±0.04),差异均有统计学意义(p<0.05);阴性质粒组与空白对照组相比,collagen-Ⅰmrna及蛋白表达无显著差异(1.19±0.07vs1;0.71±0.02vs0.68±0.04);(3)westernblot检测结果显示:三组之间smad3蛋白表达(0.77±0.01、0.75±0.03、0.78±0.04)差异均无统计学意义(p>0.05);nedd4lsirna组p-smad2/3蛋白的相对表达量(0.35±0.02)显著高于空白对照组(0.28±0.04),差异有统计学意义(P<0.05);而阴性质粒组与空白对照组相比,p-smad2/3蛋白的相对表达量无显著差异(0.27±0.01 vs 0.28±0.04)。结论:1.外源性TGF-β1可减少HSC-T6中Nedd4L-mRNA的表达。2.Nedd4L通过降解p-Smad2/3蛋白调控TGF-β1信号通路。3.Nedd4L基因通过泛素化降解p-Smad2/3,可抑制HSC合成Collagen-Ⅰ增多,是防治肝纤维化的潜在治疗靶点。