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抗药性机理的研究是抗性治理的基础,也是害虫防治的关键环节。尽管不同害虫的遗传背景有所不同,但对杀虫剂的抗性机理却相对保守。目前,害虫的抗药性机理主要涉及:害虫表皮穿透速率降低、对杀虫剂解毒代谢能力增强和杀虫剂靶标部位敏感性下降三个方面。就灰飞虱而言,表皮穿透速率降低这一机制的研究比较少,尚无相关报道,因此灰飞虱的抗药性机理研究主要涉及后两个方面。本实验室前期工作通过比较灰飞虱的溴氰菊酯抗、感品系中解毒代谢酶基因的表达量,已经寻找到多个在转录水平上高表达的解毒酶基因CYP314A1v2(2.36倍)、CYP53D1v2(5.33 倍)、CYP439A1v3(4.68 倍)、CYP6AY3v2(24 倍)、CYP6FU1(16倍)、LSCE12(11.1倍),本文利用RNA干扰技术和昆虫杆状病毒体外表达系统,进一步探究这些高表达基因与抗药性的确切关系,为进一步弄清灰飞虱对溴氰菊酯的抗性机理和演化机制,以及开发制定有效的治理措施提供理论依据。现将具体研究结果总结如下:1.灰飞虱对溴氰菊酯抗性相关解毒酶基因的RNA干扰效应本研究采用RNA干扰的方法,通过沉默这些过表达基因,检测它们在溴氰菊酯抗性中的作用。研究结果表明,以含有50 ng/μl相应dsRNA的营养液连续喂食灰飞虱7天,对不同抗药性相关基因都能够起到良好的干扰效果,CYP314A1v2、CYP353D1v2、CYP439A1v3、CYP4G76、CYP6AY3v2、CYP6FU1、LSCE12 基因的表达量分别下降了 51.1%、49.6%、57.3%、51.1%、59.6%、49.1%、35.3%。进一步对表达量下降的处理试虫进行毒力生测发现,单独干扰所研究的任何一个抗药性相关基因,都不能显著提高其死亡率。但同时干扰多个基因,其死亡率明显升高,且不同组合效果不同;同时干扰的基因越多,敏感性提高幅度越大。表明这些基因均在灰飞虱的溴氰菊酯抗性中发挥作用,但单个基因的作用较小,且存在一定差异,只有多个基因共同作用时,才能产生较高的抗药性。2.灰飞虱对溴氰菊酯抗性相关代谢酶基因的体外功能表达为了进一步明确前期发现的灰飞虱抗药性相关代谢酶基因的功能,本章利用昆虫杆状病毒表达系统,对其中2个细胞色素P450氧化酶进行了体外表达和功能验证。首先,构建成功了 3个pFastBacHTA的重组供体质粒,分别命名为pFastBacHTA-CYP6AY3v2、pFastBacHTA-CYP6FU1、pFastBacHTA-CPR;其次,使用昆虫细胞系sf9为宿主,在体外表达CYP6A3v2、CYP6FU1、CPR基因,Westernblot检测得到了大小分别为61kDa、57 kDa、79 kDa的目标蛋白,并通过活力测定表现出了较强的酶学活力,表明基因得到了成功的表达;最后,探究了重组表达的细胞色素P450对溴氰菊酯的代谢活性,经RP-HPLC检测发现,所研究的2个CYP基因表达产物,均能将溴氰菊酯氧化代谢为无毒的4-羟基-溴氰菊酯。由此证实前期发现的抗药性相关解毒酶基因中,至少所研究的2个细胞色素P450基因CYP6AY3v2和CYP6FU1,均参与了灰飞虱对溴氰菊酯的代谢抗性。本研究筛选优化了喂食干扰灰飞虱抗药性相关解毒酶基因的相关条件,确定了具有稳定效果的干扰试验方法。利用基因沉默检测抗药性相关基因的功能,发现单个基对灰飞虱抗药性的贡献有限,多个抗药性相关解毒酶基因的联合作用才能产生较大的抗药性变化。利用昆虫杆状病毒表达系统,体外表抗药性相关解毒酶基因发现,所测定的两个酶均可以将溴氰菊酯氧化代谢为无毒的4-羟基-溴氰菊酯,并由此证实CYP6AY3v2和CYP6FU1的过表达均参与了灰飞虱对溴氰菊酯的抗性形成。这些研究结果对于了解灰飞虱抗药性的发生和治理均有重要意义。