论文部分内容阅读
目的：探讨快速老化小鼠听觉功能、耳蜗组织中神经生长因子受体酪氨酸激酶受体A（nerve growth factor receptor TrkA，NGFR TrkA）表达的增龄性变化以及NGF转染骨髓基质干细胞的培养，为老年性耳聋发病的分子机制和基因治疗提供理论基础。方法：该研究选用3、5、7月龄的快速老化小鼠亚系8（SAMP8）作为观察对象。采用听觉诱发反应仪检测其8kHz短纯音ABR阈值；应用免疫组化染色检测NGFR TrkA在耳蜗组织中的表达情况，并应用光密度检测分析其增龄性变化特点。将欲转染的小鼠骨髓基质干细胞分为四组：A组为脂质体2000包裹的重组质粒转染组；B组为脂质体转染组；C组为脂质体包裹的空质粒转染组；D组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液的阴性对照组。按质粒提取试剂盒说明提取含NGF重组质粒的阳性克隆大肠杆菌，将提取的重组质粒经限制性内切酶HindIII and XhoI双酶切鉴定后，采用脂质体Lipofectamine TM2000转染方法将含有人β-NGF神经生长因子的重组质粒转染至小鼠骨髓基质干细胞中，于转染48小时后用4%多聚甲醛固定各组细胞并通过细胞免疫组化染色检测NGF的表达情况。结果：1、各组SAMP8小鼠听性脑干反应阈值（ABR）分别为：3月龄SAMP8小鼠：左耳为31.667±2.582，右耳为32.500±2.739；5月龄SAMP8小鼠：左耳为54.167±2.041，右耳为53.333±2.582；7月龄SAMP8小鼠：左耳为58.333±2.582，右耳为58.333±2.582。5月龄与3月龄进行比较P＜0.05，7月龄与5月龄进行比较P＜0.05有显著性差异。2、NGFR TrkA蛋白在不同月龄快速老化小鼠耳蜗组织中均有表达，且主要表达于螺旋神经节细胞和内外毛细胞的胞核和胞浆。各组小鼠耳蜗螺旋神经节细胞TrkA免疫组化染色平均光密度值分别为：3月龄SAMP8小鼠：0.5262±0.0148；5月龄SAMP8小鼠：0.4758±0.0129；7月龄SAMP8小鼠：0.4505±0.0148。5月龄与3月龄进行比较P＜0.05，7月龄与5月龄进行比较P＜0.05有显著性差异。各组小鼠耳蜗内外毛细胞TrkA免疫组化染色平均光密度值分别为：3月龄SAMP8小鼠：0.6311±0.0200；5月龄SAMP8小鼠：0.5487±0.0179；7月龄SAMP8小鼠：0.5183±0.0187。5月龄与3月龄进行比较P＜0.05，7月龄与5月龄进行比较P＜0.05有显著性差异。3、各组骨髓基质干细胞胞浆均可见棕黄色颗粒，且脂质体2000包裹的重组质粒转染组（A组）NGF表达明显高于其他组，与其他组进行比较P＜0.05有显著性差异。结论：NGFR TrkA蛋白的表达水平随着快速老化小鼠听觉功能增龄性减退而降低，说明NGFR TrkA可能与维持耳蜗的功能状态有关；采用脂质体Lipofectamine TM2000转染方法能将NGF重组质粒成功转染至骨髓基质干细胞并能在中表达，为应用β-NGF修饰的骨髓基质干细胞进行耳蜗移植治疗老年聋的动物实验研究提供前提和理论基础。