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铜诱导型启动子可以在铜离子的诱导下而激活,从而启动目的基因的表达。它主要由两部分构成;(1)铜激活转录因子ACE1;(2) ACE1蛋白结合位点的金属响应元件MRE,其作用机制为;ACE1蛋白结合铜离子后改变构象,并结合到金属响应元件MRE上,激活启动子的转录活性,从而促进目的基因的表达。
IbMYB是紫心甘薯中花青素合成途径中起调控的转录因子基因。研究表明其超量表达能够提高烟草叶片中花青素的积累,加深叶片的颜色;IbCHS是紫心甘薯花青素合成途径中的关键合成酶基因,其表达水平与花青素的含量呈正向对应关系。
本研究旨在将铜诱导型启动子和花青素合成调控基因应用于植物叶色基因工程,因此构建由铜诱导表达系统调控IbMYB基因和IbCHS基因的植物双元表达载体,并将其转化烟草和拟南芥,观察其表型变化,以期得到人工调控植物叶色的方法。
本研究通过基因重组技术对不同元件组成的植物表达载体进行了分子检测和功能鉴定,获得了下列结果;
1)克隆获得ACE1和GFP基因全长,成功构建铜诱导GFP基因表达载体(pCambia1300-ACE1-GFP)。将含表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片,转化后的叶盘可受铜离子的诱导而表达GFP,说明载体中的ACE1能够响应铜离子的诱导并与MRE元件结合从而启动下游基因的表达。获得经PCR鉴定的稳定转化后的转基因烟草,并且烟草叶片能够响应铜离子的诱导而表达GFP。
2)克隆获得IbMYB基因全长,成功构建铜诱导IbMYB基因表达载体(pCambia1300-ACE1-MYB)。将含表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片,转化后的叶盘颜色在铜离子的诱导下有不同程度的加深,说明构建的载体能够响应铜离子的诱导而表达IbMYB,提高花青素的积累量。获得经PCR鉴定的稳定转化后的转基因烟草。
3)克隆获得IbCHS基因全长,成功构建铜诱导IbCHS基因表达载体(pCambia1300-ACE1-CHS)。将含表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片,转化后的叶盘颜色在铜离子的诱导下有不同程度的加深,说明构建的载体能够响应铜离子的诱导而表达IbCHS,提高花青素的积累量。
4)成功构建铜诱导IbMYB和IbCHS基因共表达载体(pCambia1300-ACE1-MYB-CHS)。将含表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片,转化后的叶盘颜色在铜离子的诱导下有不同程度的加深,说明构建的载体能够响应铜离子的诱导而表达IbCHS,提高花青素的积累量。
以上研究结果初步显示,本文所构建的铜诱导型启动子可以诱导驱动目的基因在转基因烟草叶片中表达,IbMYB和IbCHS的诱导超量表达可以加深烟草叶片的颜色,这为进一步将铜诱导型启动子及花青素表达调控基因应用于植物叶色改良基因工程提供了实验依据。