研究背景：　　 支气管哮喘是一种由多种细胞、细胞因子和炎症介质引起的以呼吸道高反应性为特征的变态反应性慢性炎症性疾病。呼吸道慢性炎症，初始可引起呼吸道功能性改变，由于炎症反复刺激，可演变为呼吸道结构性改变，即气道重塑。白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13(IL-13)两种细胞因子通过多种作用机制参与气道高反应与呼吸道重塑的病理生理过程。儿童轻度哮喘多能控制良好，而中重度哮喘部分难以控制，其机制尚不明确，因此深入研究哮喘儿童的气道高反应及气道重塑机制有望改善其治疗效果。　　 气道重塑是慢性炎症基础上损伤修复过程，哮喘的炎症涉及多种活化细胞包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞、成肌纤维细胞等等。这些细胞释放促炎症细胞因子介质及生长因子，促进及调节气道炎症及气道上皮、成肌纤维细胞、杯状细胞、血管内皮细胞等分化增生(TGF-β1、VEGF、FIZZ1等)，炎症效应引起不可逆的气道结构及功能上改变，其结构性特征是气道壁增厚、上皮下组织纤维化、平滑肌细胞增生肥大、杯状细胞及粘液腺增生、血管生成，引起气道高反应性及气道阻塞，从而出现呼吸困难、喘息、胸闷等症状。既往有研究通过胸部CT检查测定气道壁面积和厚度，结果显示哮喘患者气道壁厚度、气道壁面积与体表面积之比明显高于健康对照者，哮喘患者的支气管壁厚度与病情严重度成正相关。因此对哮喘患者进行胸部CT检查可了解其气道重塑严重程度及气流受阻情况。　　 气道重塑于哮喘的早期既已发生，已有研究显示激素应用并不能逆转气道重塑的过程。所以研究何种炎症细胞及炎性因子在气道重塑中起作用，可为抑制和逆转气道重塑的治疗提供新的思路。　　 IL-4是T辅助细胞(TH)经抗原或丝裂原刺激而产生的一种细胞因子，是由T细胞、嗜碱粒细胞和肥大细胞产生的一种多功能炎性介质，由CD4+细胞分泌。IL-4能通过自身分泌方式促进T细胞向Th2型分化，导致TH1/TH2平衡失调，从而诱导哮喘的发生。国外学者已证实IL-4可诱导B淋巴细胞合成IgE，而抗IL-4抗体则可抑制IgE的分泌，可见IL-4在哮喘的Ⅰ型变态反应发生中起着重要作用，与气道高反应性密切相关。另外IL-4通过促进内皮细胞粘附因子-Ⅰ(VCAM-1)表达，诱导淋巴细胞的粘附和嗜酸粒细胞的趋化，参与气道炎症，另外高水平的IL-4还通过增加纤维母细胞的增生和胶原质的合成而促进慢性呼吸系统疾病晚期(包括哮喘晚期)肺纤维化的发生。　　 靶细胞上存在两型IL-4R，Ⅰ型IL-4R是由IL-4Ra链(P140)和rc链(即IL-2Rr链，CD132)组成，主要在造血细胞上表达；Ⅱ型IL-4R是由IL-4Ra链和IL-13Ra1链组成。Gauehat等从B细胞cDNA文库中克隆了一个4kb的人IL-13R，发现当这种IL-13R单独表达时能与IL-13结合，当它与IL-4Ra链结合成受体复合物时能与IL-4和IL-13同时结合。这可能是IL-4和IL-13在哮喘发病时具有协同作用的分子生物学基础。　　 人IL-13主要由辅助T细胞(TH2)产生，肥大细胞、嗜碱性粒细胞也能产生，其基因位于第5号染色体上，与IL-4基因紧密连接，IL-13的氨基酸序列与IL-4有20％～25％的同源性，在功能上也有许多相似之处，IL-13通过多种作用机制参与呼吸道重塑的病理生理过程。Kumar与Saito等发现IL-13能刺激成纤维细胞活化、增殖及产生纤维素，并能刺激人肺纤维细胞向成肌纤维细胞分化，增加平滑肌细胞的有丝分裂，促进平滑肌增生肥厚。Wen等证明IL-13能够刺激支气管上皮细胞产生TGF-β，并同时伴mRNA表达增加，且IL-13的这种作用能被IFN-γ削弱。Laporte等还发现IL-13能通过MAP激酶途径显著减少β-肾上腺素能受体诱导的平滑肌细胞松弛效应。IL-13能在TNF-α转化酶介导下诱导呼吸道上皮细胞分泌黏液和TGF-β产生，最终导致呼吸道杯状细胞增生及黏液过度分泌。可见IL-13可能主要参与呼吸道重塑过程，并与气道高反应性及黏液过度分泌有关。　　 基于以上理论，本实验拟结合临床哮喘患儿的临床病情及其外周血单个核细胞(PBMC)分泌IL-4、IL-13水平的改变进行分析研究，从而了解IL-4、IL-13与哮喘病情及气道重塑中的相关性，为哮喘(尤其是难治性哮喘)的新治疗手段提供实验基础。　　 研究目的：　　 1.研究哮喘患儿外周血单个核细胞分泌IL-4、IL-13水平与哮喘病情的关系；　　 2.探讨HRCT用于评估哮喘儿童气道重塑情况的可能性。　　 研究对象与方法：　　 1.研究对象　　 选择支气管哮喘患儿60例，其中急性发作期哮喘患儿为35例，缓解期哮喘患儿为25例，25例缓解期患儿均经正规联合治疗达到临床缓解。同期健康儿童30例设为正常对照者。选取11例病程较长的病人于其临床缓解期行胸部高分辨CT，11例患者病程范围为3～8年，病程中位数为4.5年。选取我院就诊的其它系统疾病的13例患儿的胸部高分辨CT为对照。经统计分析，两组男女比例、年龄均存在可比性。　　 2.研究方法　　 2.1外周血单个核细胞(PBMC)的分离和培养：　　 (1)静脉采血2ml，EDTA抗凝，PBS等体积稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上，2500转离心20分钟；　　 (2)取血浆，-200C冰箱冻存；　　 (3)吸取中间白膜层，以PBS充分洗涤后，以2000转离心10分钟，加入RPMI1640培养液调整PBMC密度为1×109/L；　　 (4)将PBMC1×109细胞/L培养于96孔培养板中，200ul/孔，加入佛波醇酯(PMA)(20ug/L)+离子霉素(ionomycin)(500ug/L)作为刺激原进行共培养；　　 (5)培养板置于370C，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，48h后收集上清冻存至-80℃冰箱。　　 2.2外周血血浆及单个核细胞(PBMC)培养上清IL-4、IL-13的测定：通过酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)测定血浆及PBMC培养上清IL-4、IL-13水平，单位为pg/ml。　　 2.3血常规、血细胞形态、IgE水平的测定　　 1)血常规：静脉采血2ml到医院检验室完成。　　 2)血细胞形态：静脉采血1ml涂片后，经HE染色和White Giemasa染色，分类计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的百分比并观察各细胞的形态。　　 3)外周血免疫球蛋白E(IgE)测定：抽取外周血1～2ml后，离心分离出血清，通过ELASA检测血清中IgE含量，IgE浓度单位是IU/ml。　　 2.4支气管壁厚度测量　　 1)取吸气末三个横断层面：主动脉弓上、气管分叉、下肺静脉，横断图像上每个层面选取双侧管腔内径0.5～2mm的气道各三支，由放射科医师测量管腔内径L、管腔外径D；　　 2)在计算机上通过程序计算气道壁的厚度T(T=(D-L)/2)、气道壁厚度与气道管腔外径之比值T/D、气道壁面积WA[WA=π(D/2)2-π(L/2)2]、气道壁面积占气道总截面积的百分比WA％=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2x100％。　　 2.5肺功能测量　　 观察指标：用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气量(FEV1)、第一秒用力呼气量/用力肺活量比值(FEV1/FVC)、75％呼气中期流量(MEF75％)、50％呼气中期流量(MEF50％)、25％呼气中期流量(MEF25％)、最大呼气峰流速(PEF)。　　 3.统计学方法　　 符合正态分布连续性计量资料用均数±标准差(X±s)表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用方差分析；双变量相关分析采取变量间pearson相关分析；非正态分布计量资料用全距(中位数)表示，两组均数比较采用秩和检验，双变量相关分析采用变量间Spearman相关分析；P＜0.05有统计学差异。所有数据统计分析均使用SPSS16.0软件包进行分析。　　 结论：　　 1.外周血嗜酸性粒细胞百分比与血清总IgE水平是哮喘诊断的有效参考指标，其中血清总IgE水平与哮喘病情分期有关，但外周血嗜酸性粒细胞百分比不能作为哮喘病情分期指标。　　 2.哮喘患儿PBMC分泌IL-4、L-13水平显著升高，同时IL-4水平与IL-13水平成正相关，并与临床分期相关。　　 3.哮喘患儿IL-4水平与血清总IgE水平(IU/ml)呈高度正相关、L-13水平与血清总IgE水平(IU/ml)呈低度正相关。　　 4.哮喘患儿IL-4、IL-13水平与肺功能(FEV1、FVC、PEF、MEF75％、MEF50％)成负相关，其中L-13水平与肺功能的相关性较IL-4密切。　　 5.哮喘患儿IL-4水平与气道重塑指标T/D(0.32±0.02)、WA％(86.42±2.61)％无相关关系；IL-13与T/D(0.32±0.02)、WA％(86.42±2.61)％成正相关。　　 6.哮喘患儿气道壁厚度与气道管腔外径之比值T/D、气道壁面积占气道总截面积的百分比WA％与FEV1、MEF25％～75％成负相关。HRCT可作为无创手段监测哮喘患儿的支气管壁厚度，评估气道重塑情况。