原生质体非对称融合技术在作物遗传改良上具有重要的应用价值,通过该技术一方面可以将细胞质雄性不育性转移到栽培品种,缩短回交转育的年限,提高杂种优势的利用效率;另一方面也可以将野生种质资源中的抗性基因转入栽培品种,提高栽培种的抗逆性。 筛选细胞分裂旺盛、不定芽发生频率较高的基因型作为受体亲本,是原生质体非对称融合成功的关键。本研究通过下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从四种甘蓝(Brassica oleracea L.)基因型中筛选出了合适的基因型。以筛选出的花椰菜“傲雪菜花一号”为受体,与Ogu CMS甘蓝型油菜(供体)进行非对称融合,研究结果如下: 1 以傲雪菜花一号、天王雪白菜花(花椰菜)、京研四季(结球甘蓝)和まり绿(青花菜)为受体亲本的筛选材料,采用下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从中筛选出不定芽发生频率较高基因型:京研四季、天王雪白菜花、傲雪菜花一号。较原生质体培养,下胚轴不定芽诱导的方法同样可以筛选出合适的基因型用以作为原生质体非对称融合的受体亲本。 2 采用PEG介导的非对称体细胞融合获得了花椰菜与Ogura萝卜胞质甘蓝型油菜种间体细胞杂种32株。 3 转育了与Ogu CMS相关的基因orf138。 4 与Ogura胞质不育性密切相关的线粒体DNA orf138的STS标记,可以作为花椰菜体细胞杂种Ogura胞质雄性不育性的分子鉴定。 5 在供、受体亲本生长的不同时期取材,进行不同种类同工酶的筛选,选出了两种在供受体亲本间表现差异明显的同工酶:过氧化物酶(POX)和磷酸葡萄糖变位酶(PGM)。 6 人工合成46条在甘蓝型油菜和甘蓝中已表现出多态性的10碱基RAPD随机引物,从中筛选出了两条供受体双亲中表现出差异的引物:H(TCG TGT TGC T)和3(CTC AGC CCA G)。 7 运用形态学、细胞生物学和分子生物学的方法鉴定获得的68株再生植株,其中32株为杂种植株。同时证明在非对称融合杂种植株鉴定中,必须采用多种鉴定方法才能得到可靠的结果。 8 随着紫外线辐射剂量的增加,融合细胞的分裂进程无明显变化,但是形成的愈伤组织的数量有明显减少的趋势。