核内有丝分裂是不同于有丝分裂的一种细胞周期形式,进行核内有丝分裂的细胞会持续进行DNA复制,而不发生胞质分离,导致进行核内有丝分裂的组织中的遗传物质含量不断增加,而细胞的数量保持不变,最终形成含有多倍体细胞的组织。核内有丝分裂可以高效提高基因组拷贝数,使得基因转录翻译进程加快,进而极大提高蛋白合成能力,使细胞在生物体生命进程中行使特定功能。核内有丝分裂细胞通常是由有丝分裂细胞分化形成。但目前核内有丝分裂的发生机制尚不完全清楚,有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的研究具有重要意义。家蚕作为泌丝经济昆虫,其丝腺组织细胞会经历有丝分裂和核内有丝分裂两个过程,在胚胎早期进行有丝分裂,在胚胎后期转为核内有丝分裂,是研究有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的理想材料。此外,丝腺作为家蚕丝蛋白合成的器官,其强大的蛋白合成能力不仅使其在蚕丝生产上具有重大的经济价值,更使其具备成为新兴生物反应器的条件,对丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的研究可为改造家蚕丝腺、推进其作为生物反应器的进程、提高家蚕经济价值奠定理论基础。对核内有丝分裂发生机制的解析具有十分重要的理论和应用价值。本研究通过胚胎解剖、组织免疫荧光和荧光定量实时PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)等实验技术分析了家蚕丝腺发育中有丝分裂-核内有丝分裂转换时期。通过转录组测序分析家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换差异表达基因,结合核内有丝分裂相关基因BmGeminin2酵母双杂交数据,进行组织表达谱、丝腺发育时期表达谱分析,最终筛选获得了一个参与家蚕丝腺细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换过程的关键基因BmZFP67。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记、流式细胞术、丝腺组织体外培养、转基因以及染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)等技术分析了BmZFP67在细胞周期中的功能,研究了BmZFP67在家蚕细胞有丝分裂及丝腺组织细胞核内有丝分裂中的重要作用,构建了BmZFP67调控家蚕丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换的调控网络。这将进一步丰富和完善细胞周期调控理论,解析有丝分裂-核内有丝分裂转换机制,同时也可为家蚕丝腺核内有丝分裂效率及蚕丝产量的提高提供理论依据及科学思路。本论文的主要研究结果和结论如下:1.家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换时期分析为了筛选参与有丝分裂-核内有丝分裂转换过程的关键基因,本研究首先通过胚胎解剖技术成功获取了胚胎24期、25期和26期的完整丝腺组织。然后通过qRT-PCR技术检测细胞周期类型标记基因——Cyclin B和Cyclin E及细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)基因CDK1和CDK2在24期、25期和26期胚胎丝腺组织中的转录情况:在有丝分裂进程中需要,在核内有丝分裂进程中不需要的G2/M期细胞周期相关基因Cyclin B和CDK1在24期、25期以及26期胚胎丝腺中呈现转录水平持续性下调的趋势;有丝分裂及核内有丝分裂进程均需要的G1/S期细胞周期相关基因Cyclin E和CDK1持续表达,且在25期胚胎丝腺中的转录水平显著高于24期胚胎丝腺和26期胚胎丝腺。组织免疫荧光标记Cyclin B蛋白验证其在24期、25期和26期胚胎丝腺组织中的表达情况发现:胚胎24期时的整个丝腺中均有Cyclin B荧光信号存在,胚胎25期时仅在部分丝腺中存在荧光信号,胚胎26期丝腺组织中没有Cyclin B荧光信号的存在,与qRT-PCR结果一致。综合以上结果,结合前人研究报道,确定胚胎25期为家蚕丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂的转换时期。2.家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换调控相关基因筛选将胚胎24期(有丝分裂期)、25期丝腺材料(转换期)和26期丝腺材料(核内有丝分裂期)丝腺材料进行转录组测序,通过比对三组样品共筛选到6786个差异基因,Gene ontology(GO)分类发现这些差异基因主要属于分子功能类和生物学进程类,属于细胞组分类的基因相对较少。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)聚类分析差异基因富集到了131条信号通路中,其中包括:DNA复制通路、错配修复通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路和激素信号通路等在先前研究中已被证实与有丝分裂-核内有丝分裂转换或核内有丝分裂效率密切相关的信号通路。通过将转录组数据与先前本实验室所研究的与核内有丝分裂密切相关的Geminin2蛋白的酵母双杂交数据联合分析,发现有14个共有基因。随后对这14个基因进行功能分析发现BmZFP67是唯一的转录调控因子基因。分析BmZFP67基因在家蚕各组织以及丝腺发育时期的表达模式发现:BmZFP67在丝腺组织中的表达量显著低于其它不进行核内有丝分裂的任何组织,且在丝腺有丝分裂-核内有丝分裂的转换过程中转录水平呈现下调趋势,暗示了BmZFP67可能在家蚕丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换过程中发挥功能。因此决定以转录调控因子基因BmZFP67作为后期的主要研究对象。3.BmZFP67在家蚕细胞及丝腺组织中的功能研究利用生物信息学、分子克隆技术及qRT-PCR技术对筛选到的家蚕BmZFP67基因进行克隆及生物信息学分析,并对其在细胞周期各时相的表达特征进行了分析。研究结果表明:BmZFP67基因编码518个氨基酸,其编码的蛋白大小约为59kDa;其同源蛋白主要存在于鳞翅目昆虫中;BmZFP67基因在细胞周期时相的S期、G2/M期转录水平较高。通过基因编辑、BrdU标记、流式细胞术、MTS细胞增殖活力检测、qRT-PCR、细胞染色及形态观察等技术实现BmZFP67基因的过表达和敲除,研究BmZFP67在细胞水平的功能。研究结果表明:BmZFP67过表达会抑制细胞增殖,导致S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高,G2/M期细胞周期蛋白基因Cyclin B和CDK1的转录水平显著性上调。敲除BmZFP67会导致Cyclin B和CDK1的转录水平显著性下调,S期细胞比例升高,G2/M期细胞比例降低,造成细胞分裂异常,导致异倍体细胞数目增多,细胞体积变大,引发类似于有丝分裂向核内有丝分裂转换现象的发生。通过转基因技术构建丝腺组织特异表达系统,实现BmZFP67基因在丝腺组织中的特异过表达和敲除。通过丝腺组织体外培养结合BrdU标记、丝腺组织免疫荧光、qRT-PCR等技术研究在丝腺组织中特异过表达或敲除BmZFP67基因对家蚕丝腺发育、丝蛋白产量等的影响。研究表明:丝腺组织中过表达BmZFP67会造成丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换期的推迟,且会显著性降低丝腺组织细胞核内有丝分裂效率,降低其丝蛋白合成能力。4.BmZFP67基因调控网络研究通过qRT-PCR技术、染色质免疫共沉淀技术、双荧光素酶报告系统鉴定BmZFP67蛋白的转录调控靶基因,结果显示BmZFP67蛋白对M期细胞周期蛋白基因Cyclin B具有正向转录调控作用,其转录调控位点为sna位点。通过蛋白质免疫共沉淀、qRT-PCR鉴定BmZFP67相互作用蛋白并研究互作蛋白与BmZFP67的相互作用对其转录调控功能的影响,结果显示:互作蛋白14-3-3ζ或Aurora-B kinase与BmZFP67蛋白结合都会促进BmZFP67转录调控功能发挥,促进BmZFP67蛋白转录调控下游基因Cyclin B的表达。综合上述研究结果推测BmZFP67的功能及调控网络:BmZFP67在有丝分裂细胞周期G2/M期高量表达,促进其转录调控下游基因Cyclin B,即细胞周期G2/M期的关键调控基因表达上调,实现细胞周期G2/M的推进,在这一过程中BmZFP67蛋白的功能发挥还受到相互作用蛋白14-3-3ζ或Aurora-B kinase的促进。BmZFP67基因在丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换过程中表达量下降,进而导致其下游基因Cyclin B表达下调,使丝腺组织细胞不能通过G2/M期检验点,阻碍M期进程,促使丝腺组织细胞只有DNA的复制,没有细胞质的分裂,实现有丝分裂-核内有丝分裂的转换。