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研究目的:口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）是口腔颌面头颈部最常见的恶性肿瘤,约占90%。近年来随着传统治疗手段如手术治疗、放疗和化疗等的提高,患者的预后得到一定改善,但5年生存率仍约为50%左右。口腔鳞癌患者的死亡原因主要为向远处脏器转移,尤其是肺转移,而传统的治疗手段常常对晚期的肺转移患者没有疗效。因此探讨影响口腔鳞癌肺转移的机制,对于开发新的治疗药物,改善患者预后和延长生存率具有重大的临床意义。转移的过程十分复杂,包含肿瘤细胞在原发灶生长迁移,进入血管,在外周血循环中生存,穿出血管,到达转移部位定植并生长繁殖。转移的过程中肿瘤细胞与其他细胞相互作用,帮助其完成种植转移。髓样细胞（Myeloid Cells）即由骨髓发育而来的细胞,主要包含肿瘤相关巨噬细胞（Tumor Associated Macrophages,TAMs）和骨髓来源抑制细胞（Myeloid Derived Suppressor Cells,MDSCs）。MDSCs可分为单核细胞样骨髓来源抑制细胞（Monocytic MDSCs,M-MDSCs）和多个核细胞的骨髓来源抑制细胞（Polymorphonucler MDSCs,PMN-MDSC）。TAMs和MDSCs在肿瘤组织中大量存在,与癌症的侵袭和转移密切相关,参与肿瘤转移的各个过程。研究发现髓样细胞一方面可直接影响肿瘤细胞的迁移侵袭;另一方面可通过影响其他肿瘤间质来促进癌症转移如促进肿瘤中异常血管形成,增加血管通透性,利于肿瘤细胞进出血管;抑制T细胞的免疫反应,帮助肿瘤细胞免疫逃逸;以及重塑肿瘤细胞外基质,降解胶原纤维,促进癌细胞侵袭转移。但是目前髓样细胞在口腔鳞状细胞癌中的作用,尤其是对转移的影响并不十分清楚。本研究旨在探讨髓样细胞TAMs和MDSCs对口腔鳞癌转移的影响,从而为未来口腔鳞癌肺转移的治疗提供理论指导和思路。研究发现诱导性一氧化氮合酶（Induced Nitric Oxide Synthase,i NOS）在多种肿瘤组织中高表达,主要由TAMs和MDSCs产生。其可降解精氨酸产生一氧化氮（Nitric Oxide,NO）,过氧硝酸盐等代谢产物,促进肿瘤发生发展。同时i NOS还是TAMs和MDSCs发挥功能的重要因子,靶向调节i NOS可通过调控髓样细胞进而抑制肿瘤的发生发展。有学者发现i NOS在口腔癌组织中高表达,并且与不良预后有关。L-NIL为i NOS选择性抑制剂,可通过多种方式抑制肿瘤的生长,但是对肺转移的影响目前还未有人有研究。其在口腔鳞癌中的作用尚不清楚。本实验拟探究L-NIL对口腔鳞癌生长转移的影响及作用机制。研究方法:1、利用免疫组织化学染色检测口腔鳞癌组织中巨噬细胞和骨髓来源抑制细胞的分布及类型。2、体外采用佛波酯（Phorbol Myristate Acetate,PMA）和白介素-4（Interleukin-4,IL-4）诱导THP-1细胞极化为M2型TAMs,并利用q PCR及免疫荧光进行M2型TAMs的表型鉴定。3、利用M2型TAMs条件培养基（Conditioned Media,CM）处理肿瘤细胞,q PCR和免疫荧光检测M2型TAMs对肿瘤细胞上皮间充质转化（Epithelial Mesenchymal Transition,EMT）的影响。4、利用q PCR和免疫荧光检测M2型TAMs对肿瘤细胞干性的影响。5、采用划痕和Transwell侵袭实验观察M2型TAMs对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响。6、体内利用Anti-Gr1抗体清除荷瘤小鼠体内MDSCs细胞,检测其对口腔鳞癌转移的影响。7、流式细胞术和免疫组化验证肿瘤及脾脏组织中MDSCs的清除效率。8、免疫组化检测i NOS在癌组织中的分布。9、体内应用L-NIL观察其对小鼠口腔鳞癌生长的影响。10、小动物活体成像和HE染色观察L-NIL对口腔鳞癌肺转移的作用。11、利用Kaplan-Meier方法进行小鼠生存率分析。12、硝酸盐/亚硝酸盐试剂盒检测NO代谢产物的改变。13、免疫组化检测L-NIL对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。14、质谱流式（Mass cytometry,Cy TOF）检测L-NIL对免疫微环境的作用。15、免疫组化和流式细胞术进一步验证L-NIL对肿瘤组织及脾中TAMs及MDSCs的影响。16、细胞因子array检测血浆及肿瘤组织中细胞因子的变化。17、体内应用CXCR2抑制剂SB225002观察其对口腔鳞癌转移的影响。18、流式细胞术和免疫组化染色验证CXCR2抑制剂SB225002对MDSCs浸润的影响。19、统计学分析:所有体外实验均重复3次,体内动物实验至少重复2次,实验结果按照平均数±标准差表示。符合正态分布的两组数据利用Student’s t检验进行统计学分析;不符合正态分布的数据采用非参数Mann-Whitney U检验进行分析。P<0.05表示具有统计学差异。研究结果:1、免疫组化染色结果显示口腔癌组织中分布大量CD68+的TAMs,且主要表现为CD163+的M2表型,癌组织中CD68+TAMs明显较正常上皮组织多;同时我们发现癌组织中CD14+的M-MDSCs和CD15+的PMN-MDSCs也明显较正常上皮组织多。2、q PCR结果显示和单纯PMA处理组相比,加入PMA+IL-4诱导处理48h后M2型巨噬细胞相关基因CD163,CD206和Arg1表达升高,免疫荧光实验进一步验证CD163和CD206蛋白也增多。3、利用q PCR我们发现上皮和细胞连接相关基因E-cadherin、Occudin和ZO-1表达减少;间质的标志Vimentin和Snail1升高。同时免疫荧光结果进一步验证E-cadherin蛋白减少,Vimentin蛋白升高。4、q PCR和免疫荧光结果显示M2型TAMs CM处理后口腔癌细胞获得干性,表现为干性基因Sox2,Oct4和Nanog上调,干性蛋白CD44和CD105表达增多。5、划痕和侵袭实验表明M2型TAMs可增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。6、体内应用Anti-Gr1中和抗体可有效清除MDSCs,并且清除MDSCs后可明显抑制口腔鳞癌的肺转移。7、免疫组化染色结果发现i NOS在小鼠口腔癌组织中大量表达。8、利用小动物活体成像和HE染色观察发现:与对照组相比,体内应用i NOS抑制剂L-NIL可抑制小鼠口腔鳞癌的生长和转移。9、免疫组织化学染色结果显示L-NIL处理后:Ki67+的增殖的肿瘤细胞减少,Cleaved-caspase3+的凋亡的肿瘤细胞变多。10、质谱流式Cy TOF结果表明L-NIL处理后肿瘤组织中MDSCs大量减少,TAMs少量减少。11、流式细胞术和免疫组化进一步验证发现:L-NIL处理小鼠后,肿瘤组织内的Ly6G+PMN-MDSCs和Ly6C+的M-MDSCs均变少,但对脾脏中的MDSCs无影响。同样,我们发现肿瘤及脾脏中F4/80+的巨噬细胞、CD163+的M2型巨噬细胞和CD86+的M1型巨噬细胞都没有明显改变。12、细胞因子array结果显示:L-NIL处理组小鼠血浆中趋化因子CXCL5明显降低。13、与对照组相比,体内应用CXCL5特异性受体CXCR2抑制剂SB225002后可明显抑制MDSCs在肿瘤中的浸润,并且CXCR2抑制剂SB225002组的肺转移数量明显减少。结论:髓样细胞可促进口腔鳞癌侵袭转移;i NOS抑制剂L-NIL可能通过调控CXCL5/CXCR2信号抑制MDSCs浸润进而抑制口腔鳞癌的生长和转移。CXCR2抑制剂SB225002可抑制口腔鳞癌肺转移。