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背景:心血管疾病是危害人类身体健康最严重的疾病之一，而冠心病又是最常见的心血管疾病。冠心病的治疗以积极的溶栓，冠脉支架等手段为主，但是当对心肌恢复血流供应后，发现细胞的功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重，即产生心肌缺血/再灌注损伤。再灌注时产生大量的活性氧，诱导细胞死亡。并且，尽管在缺氧的时候，氧含量比较低，越来越多的研究表明这段时期也有活性氧的产生，并与细胞的凋亡相关。心脏作为人体中最大的能量消耗器官，一旦发生心肌缺血缺氧，则心脏功能障碍更加严重。目前认为引起心肌损伤可能的机制主要有ATP供给不足，钙离子内流和氧化应激损伤严重，增加了线粒体膜的通透性，从而激活了线粒体凋亡通路。因此，如果某个生物小分子在心肌缺血再灌注的时候可以切断上述某个或多个环节之间的联系，阻断线粒体凋亡通路的激活，那么它也就可以减少心肌细胞的凋亡，发挥心肌保护作用，即有可能被用于预防或者治疗心肌供血不足的疾病。黄连素（BBR），属于异喹啉衍生物类生物碱，是传统中药黄连的重要组成部分。在祖国传统医学里，长期以来它被用来治疗腹泻和消化系统疾病。目前越来越多的研究表明，BBR还具有增加心肌收缩力，改善心肌供血，抗心律失常及调压降脂等功效。BBR对多种心血管疾病有良好的防治作用，但是对于其作用机制目前尚不很清楚。本次实验的目的是探讨BBR对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其分子机制。目的：1.观察BBR对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。2.研究BBR抑制H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制。方法：实验Ⅰ：首先筛查缺氧/复氧(H/R)的有效时间段，建立心肌H/R损伤模型。具体分组如下：正常对照组，不同的时间段的H/R组（1h/23h;2h/22h;4h/20h;8h/16h;12h/12h;16h/8h）组，将H9C2心肌细胞根据以上分组分别处理，筛选出最终的有效时间段，最后选定H/R4/20h作为以后实验模型组。然后，用MTT的方法检测BBR对H9C2心肌细胞活力的影响。具体分组如下：正常对照组，不同浓度的BBR组（10,20,50,100，150，200μmol/L）。最后，观察BBR对心肌的保护作用，具体分组如下：正常对照组（Con），BBR单纯处理组(Ber)，H/R (4/20h）模型组(H/R)，不同浓度BBR预处理H/R（10,100μmol/L+H/R）组(L-Ber; H-Ber)。用核染色标记的Hoechst33258观察H9C2细胞核凋亡的形态学变化。用流式细胞仪检测细胞的凋亡比率。根据乳酸脱氢固氮酶（LDH）测定试剂盒的说明测定LDH。实验Ⅱ：初步探讨BBR对H9C2心肌H/R损伤的保护机制。根据实验Ⅰ的设计，设置正常对照组（Con），BBR单纯处理组(Ber)，H/R (4/20h）模型组(H/R)，不同浓度BBR预处理H/R（10,100μmol/L+H/R）组(L-Ber; H-Ber)。用细胞探针罗丹明123观察线粒体膜电位（MMP）的变化。用免疫印迹法检测胞浆裂解物中Bcl-2，Bax，Cyt c，Smac和Caspase-3，6，9的蛋白表达情况。结果：实验Ⅰ：1.MTT法检测H9C2细胞活力，与对照组比较，H/R模型组的细胞活力是（48.6±1.3）％（P <0.01），而10,100μmol/L的BBR预处理24小时后，与H/R组（48.6±1.3％）相比，预处理组的细胞活力分别上升到（67.6±2.2）％（P<0.01），（82.6±1.5）％（P <0.01）。而单纯BBR（100μmol/L）对H9C2细胞活力无明显影响(Fig.2)。2.评估BBR对H/R诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用，本文以LDH释放作为观察指标。在H/R（4/20h）处理细胞后，与对照组比较，LDH释放量显著上升，232.1±6.60％(Fig.2)，但在10,100μmol/LBBR预处理24小时后，与对照组比较，LDH释放分别被显著下降至173.9±5.6％（P<0.05），127.4±4.6％（P <0.01）。3.用膜渗透性染料Hechst33258观察细胞核的凋亡情况，正常情况下细胞核呈均匀弥漫着色，边缘光滑整齐。而本次实验结果也表明，正常对照组的细胞核呈均匀弥漫蓝染，而H/R（4/20h）处理后的模型组染色质呈致密深染，皱缩碎裂，显示明亮的蓝色荧光。但在BBR10,100μmol/L预处理后，细胞凋亡显著得到改善。另外BBR单独处理对H9C2细胞核无明显的影响(Fig.3)。4.用FCM法检测细胞的凋亡比率，本次的实验结果表明，和正常对照组，BBR单独治疗组比较，H/R（4/20h）模型处理组细胞凋亡的比例分别从1.8％和1.6％上升到46.2％。而用BBR（10,100μmol/L）预处理细胞后凋亡比率分别降至33.7％和8.4％(Fig.4)。实验Ⅱ：1.用荧光染料罗丹明123测量线粒体膜电位。为了明确H/R（4/20h）和/或BBR对于MMP变化的影响，我们通过用荧光探针罗丹明123观察细胞MMP的完整性。与对照(Fig.5)相比较， H9C2细胞在H/R（4/20小时）处理后，罗丹明123的荧光强度显著降低。而BBR预处理后，可以剂量依赖性地减弱H/R（4/20小时）引起的H9C2细胞线粒体膜电位的变化。BBR（100μmol/L）单独应用对H9C2细胞线粒体膜电位无明显影响。2．Western Blot的结果显示，H9C2细胞H/R（4/20h）处理后，胞浆中Bax，Cyt C，Smac和Caspase-3，6，9分别显著增加，而Bcl-2显著减少。然而，BBR（10，100μmol/L）预处理后可以显著抑制H/R诱导的这些表达变化。此外，BBR（100μmol/L）单独处理没有对H9C2细胞这些蛋白表达产生显著性影响(Fig.6,7,8)。结论：1.BBR可以显著减轻H/R诱导的H9C2细胞的凋亡2.在H/R诱导的H9C2细胞凋亡中，BBR可能是通过提高Bcl-2/Bax比值，抑制线粒体caspase通路，从而发挥了心肌保护作用