近视眼是全世界范围内最常见的眼部异常之一，因此研究近视眼的发病机制具有深远的社会意义。目前近视眼研究中，形觉剥夺作为一种经典的近视诱导手段，而20Hz左右的闪烁光则被认为可以有效地延缓近视的发展。因此，本课题通过蛋白组学技术和基因芯片技术初探形觉剥夺和闪烁光对C57BL/6J小鼠视网膜蛋白质和基因表达的影响，旨在进一步了解近视眼发生以及闪烁光延缓近视眼的视网膜机制。 （一）应用功能蛋白质组学技术初探闪烁光和形觉剥夺对视网膜蛋白表达谱的影响 研究目的：通过应用功能蛋白组学技术研究形觉剥夺和闪烁光对C57BL/6J小鼠视网膜蛋白表达谱的影响，构建可能参与近视发生或闪烁光延缓近视的视网膜机制的蛋白质互助网络。 研究方法：约4周的C57BL/6J小鼠48只，随机分为3组：Ⅰ：形觉剥夺组（N=16）；Ⅱ：形觉剥夺+闪烁光组（N=16）；Ⅲ：空白对照组（N=16）。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠随机选取一只眼为形觉剥夺眼；Ⅲ组小鼠的双眼均未经视觉干扰处理，作为空白对照。其中Ⅰ组和Ⅲ组小鼠采用正常日光灯照明，而Ⅱ组小鼠暴露于20Hz左右的闪烁光。匹配三组小鼠眼水平的光照度为30lux，光照周期为12h：12h。视觉处理14天后，断颈法处死动物，分离视网膜，提取视网膜总蛋白，进行双向凝胶电泳。凝胶采用铐玛斯亮蓝染色后，应用ImageMaster2D Platinum5．0软件分析凝胶，根据差异倍数>2倍选取差异表达蛋白点。切取差异表达蛋白点用胰酶消化并进行MALDI—TOF质谱分析和NCBI数据库查询。选取差异倍数最大的蛋白点进行Western Blotting验证。 结果：凝胶图像分析软件分析显示，形觉剥夺组实验眼（FD—Treated）和形觉剥夺+闪烁光组实验眼（Flicker—Treated）之间存在5个差异表达蛋白。质谱分析最后确认这5个蛋白点均归属于晶状体蛋白家族的成员：α—A—晶体蛋白、晶体蛋白βA1、α—A—晶状体蛋白、晶体蛋白βA2、晶体蛋白βA1。然后，通过对α—A—晶体蛋白的Western Blotting验证分析发现，相对空白对照眼（Control），形觉剥夺组实验眼（FD—Treated）视网膜α—A—晶体蛋白表达显著上调（P=0．033）；相反，相对于形觉剥夺组实验眼（FD—Treated），形觉剥夺+闪烁光组实验眼（Flicker—Treated）视网膜α—A—晶体蛋白的表达下调。 结论：形觉剥夺和闪烁光已被证实分别为近视诱导/阻遏的视觉信号。本实验结果显示，形觉剥夺能使α—A—晶体蛋白等部分晶体蛋白家族成员表达上调，相反，闪烁光则下调这些晶体蛋白家族成员的表达。这表明，晶体蛋白家族的某些成员可能参与了近视眼眼球生长调控。本课题的下一步研究将进一步深入探讨晶体蛋白相关的蛋白网络在近视眼发生中扮演的角色。 （二）形觉剥夺和闪烁光对视网膜基因差异表达谱的影响 研究目的：采用基因芯片技术研究短时间形觉剥夺和闪烁光导致的视网膜基因表达谱的影响，构建可能参与近视发生或闪烁光延缓近视的视网膜机制的基因调控网络。 研究方法：54只约4周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为3批（每批小鼠为18只。但是第三批实验过程中，由于1小鼠出现实验意外，故该批小鼠的数目减为15只），连续3天完成实验。然后，每批18小鼠（第三批为15只）均随机分为3组（同第一部分）：Ⅰ：形觉剥夺组（N1，2=6，N3=5）；Ⅱ：形觉剥夺+闪烁光组（N1，2=6，N3=5）；Ⅲ：空白对照组（N1，2=6，N3=5）。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠均选取随机眼为形觉剥夺眼，对侧眼作为自身对照；Ⅲ组小鼠的双眼均未经视觉干扰处理，作为空白对照。其中Ⅰ组和Ⅲ组小鼠采用正常日光灯照明，而Ⅱ组小鼠暴露于20Hz的闪烁光。匹配三组小鼠眼水平的光照度为30lux，光照周期为12h：12h。视觉处理1小时后，断颈法处死动物，分离视网膜，提取并纯化RNA，然后进行基因芯片实验。dChip软件分析基因芯片数据，以差异倍数≥1．3和unpaired T—test检验P<0．05为标准筛选差异基因。然后应用DAVID和STRING在线分析工具对差异基因进行综合的生物信息学分析。 结果：（1）形觉剥夺组实验眼（FD—Treated）与其对侧眼（FD—lateral）比较：我们的芯片数据结果显示，形觉剥夺导致小鼠视网膜171个基因发生差异表达，其中82个基因上调，89个基因下调。可能受形觉剥夺刺激调控的信号通路或代谢过程包括Wnt信号通路、黑色素色生成以及酪氨酸代谢等5条通路。（2）形觉剥夺+闪烁光组实验眼（Flicker—Treated）和形觉剥夺组实验眼（FD—Treated）比较：我们的芯片数据结果显示，闪烁光导致小鼠视网膜204个基因发生差异表达，其中108个基因下调，96个基因上调。这些差异基因中包括多巴胺受体3、神经肽Y受体5、骨形态蛋白受体ⅠA、c—fos等。受闪烁光调控的信号通路或代谢过程包括脂质代谢和毒性以及黑色素生成等2条通路。 结论：形觉剥夺和闪烁光已被证实分别为近视诱导/阻遏的视觉信号。本实验结果显示，形觉剥夺的视觉刺激能够影响Wnt信号通路；闪烁光刺激可以下调多巴胺受体3的表达、上调骨形态蛋白受体ⅠA和c—fos的表达。因此，Wnt信号通路可能参与了形觉剥夺性近视的发生；多巴胺受体3、骨形态蛋白受体ⅠA以及c—fos等可能介导了闪烁光延缓近视的视网膜机制。