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目的：探讨20S蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）对体外扩增培养人骨髓间充质干细胞（humanbone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）增殖能力的影响，明确调控hBMSCs细胞活力的有效靶点，从而为干细胞临床移植奠定实验基础。方法：体外分离培养hBMSCs，依据体外传代次数将其分为早期组（1-3代）和晚期组（12-14代）。1.检测PSMB5在早期和晚期hBMSCs的表达变化。（1）通过溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入实验和流式细胞术检测早期和晚期hBMSCs增殖能力。（2）应用荧光酶标仪检测早期和晚期hBMSCs20S蛋白酶体活性。（3）应用real-time PCR技术分析蛋白酶体β亚单位PSMB1、 PSMB5和PSMB6的表达变化；应用Western blotting检测早期和晚期20S蛋白酶体和PSMB5亚单位的表达变化。2.构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体，并设错义序列对照，感染早期hBMSCs，观察PSMB5基因沉默对hBMSCs增殖能力的影响。（1）慢病毒感染细胞后倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，判断感染效率。（2）应用real-time PCR和Western blotting分别从基因和蛋白水平检测PSMB5抑制效率。（3）荧光酶标仪检测20S蛋白酶体活性的变化。（4）应用Ki67和BrdU免疫荧光染色检测hBMSCs增殖率，Western blotting检测细胞周期相关蛋白（Cyclin D1）的表达变化。结果：1.（1）BrdU掺入实验结果证明早期hBMSCs BrdU阳性率为68.92±7.08%，晚期hBMSCs阳性率为27.67±2.76%，提示传代晚期hBMSCs增殖能力较早期细胞显著降低(P<0.01)；流式细胞仪分析结果显示，晚期hBMSCs S期细胞(4.42±0.98%)较早期hBMSCs(13.72±1.58%)显著减少(P<0.01)，细胞增殖指数较早期细胞降低11.02±1.88%(P<0.05)，进一步说明扩增培养晚期hBMSCs增殖活力降低。（2）晚期hBMSCs20S蛋白酶体活性较早期显著降低52.99±13.08%(P<0.01)，提示20S蛋白酶体活性可能与hBMSCs细胞活力有关。（3）real-time PCR结果表明，传代晚期细胞蛋白酶体亚基PSMB1、PSMB5表达水平较早期分别降低13.0±1.0%和37.0±8.0%(P<0.01)，且PSMB5下降最为明显；同时，Western blotting实验进一步表明晚期hBMSCs20S蛋白酶体和PSMB5表达水平分别比早期下降54.51±5.94%(P<0.05)和52.99±13.08%(P<0.05)，提示20S蛋白酶体核心亚单位PSMB5可能是调控hBMSCs细胞活力的关键因素。2.（1）PSMB5-shRNA慢病毒感染早期hBMSCs，24h后隐约可见部分细胞发出绿色荧光，但是信号较弱；72h后荧光信号增强，约90%以上细胞可见绿色荧光。（2）real-time PCR和Western blotting结果证实，PSMB5-shRNA组PSMB5mRNA和蛋白的表达水平分别较GFP对照组下调93.3±0.34%(P<0.01)和56.9±13.31%(P<0.05)，提示慢病毒介导的shRNA能够有效下调目的基因PSMB5的表达水平。（3）PSMB5-shRNA组20S蛋白酶体活性较GFP对照组降低69.87±1.32%(P<0.05)，提示下调PSMB5表达水平能够降低早期hBMSCs20S蛋白酶体活性。（4）Ki67免疫荧光染色结果显示，PSMB5-shRNA组Ki67阳性率较GFP对照组降低76.18±12.37%(P<0.01)；同时BrdU掺入实验结果也证明，PSMB5-shRNA组BrdU阳性率26.14±8.13%较GFP对照组49.53±11.18%显著降低(P<0.01)，表明PSMB5基因沉默能够抑制早期hBMSCs增殖能力。此外，Western blotting实验结果证明PSMB5-shRNA组细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达水平较GFP对照组降低54.55±5.49%(P<0.05)，提示PSMB5基因下调可能通过抑制细胞周期进程，从而影响hBMSCs增殖能力。结论：（1）晚期hBMSCs增殖能力降低，并且20S蛋白酶体活性及其核心亚单位PSMB5表达水平下降。（2）应用基因沉默技术手段下调PSMB5表达水平，能够抑制早期hBMSCs增殖能力，提示PSMB5可能是影响hBMSCs增殖活力的关键靶点。