背景及目的尖锐湿疣(Condyloma acuminatum,CA)是由人乳头瘤病毒(human papilloma viruses,HPV)感染所致生殖器、肛周皮肤或黏膜增生性(亚临床感染除外)损害。CA具有传染性强、增生快、容易复发的特点。目前尖锐湿疣在我国性传播疾病中位居第二。尖锐湿疣临床多表现为生殖器或肛周菜花状或乳头状良性肿物,主要由低危型HPV感染所致,恶变概率较小,但其发病率高、潜伏感染及亚临床感染患者(主要传染源)多、传染性高,不仅严重影响患者身心健康,而且对社会和家庭造成极大危害,已引起人们的普遍关注。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种具有高度宿主和组织特异性的微小DNA病毒,人体皮肤和黏膜的鳞状上皮是其唯一宿主。目前发现HPV有180多个亚型,根据其致病力大小,可分高危、低危型。其中有40多个亚型主要感染生殖器区域。而尖锐湿疣患者主要由低危型HPV感染引起。HPV难以被机体清除的原因就在于机体不能建立有效的免疫应答反应。因此,人体机体免疫状态在HPV感染所致疾病发生发展中发挥着重要作用。机体局部免疫受抑制,缓慢的清除率和缺乏有效的免疫反应是导致HPV逃避机体免疫从而导致持续感染的原因。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是广泛分布在免疫细胞特别是非特异免疫细胞及某些体细胞表面的一类模式识别受体,其作为一类跨膜蛋白受体参与微生物PAMP的识别。TLRs可以通过识别和结合PAMPs,诱导细胞因子释放、上调共刺激分子的表达,在启动固有免疫应答的同时也为适应性免疫的启动提供必要的活化信号,在宿主中发挥重要的抗微生物免疫功能,是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。TLRs在启动机体抗病毒免疫中起重要的作用,其中最重要的是TLR3、TLR7、TLR9。TLR3启动TRIF依赖型通路,激活NF-κB; TLR7、TLR9启动MyD88依赖型通路,共同促进炎症细胞因子和干扰素调节因子的产生,IRF3、IRF7磷酸化后进入细胞核,促进下游Ⅰ型干扰素IFNα IFNβ的产生。IRF7主要调节IFNα的产生,IRF3是IFNβ产生的关键转录因子。HPV的持续感染,与其抑制和逃逸机体局部免疫有关,关键是抑制和延迟机体对HPV病毒的免疫应答,很大方面也在于影响了抗原提呈过程。朗格汉斯细胞(Langerhans cell LC)作为表皮专职抗原提呈细胞(Antigenpresented cellAPC),在表皮中处理加工并呈递抗原。在这过程中,涉及很多细胞因子,我们设想HPV影响其中的某些因子,便可抑制或延迟机体对其的免疫应答。趋化因子CXCL12与其受体CXCR4特异性结合,可促使未成熟的DC细胞摄取抗原,分泌LPS、TNF、IL-1等细胞因子,并促使成熟树突状细胞向淋巴结迁移。有研究指出CXCL12浓度的高低对T细胞作用具有双向性,可见CXCL12表达的变化影响机体抗原提呈功能。CXCL12和其受体CXCR4在肿瘤领域研究较多,包括高危型HPV所致的宫颈癌。研究表明CXCL12由于对T细胞、前B淋巴细胞、DC树突状细胞的有力趋化性从而具有调节抗肿瘤免疫的能力。CXCL12的异常表达可导致机体免疫的异常。上皮细胞黏附分子E-cadherin,对组织结构的完整性和细胞极性的维持具有重要意义。近期研究发现黏附因子E-cadherin的免疫作用,在DCs表达,可激活巨噬细胞或影响细胞内的信号通路。上皮组织中E-cadherin介导朗格汉斯细胞和角质形成细胞(Keratinocyte KC)细胞间的黏附。LC从上皮组织迁移到局部淋巴结过程的第一步就是LC和KC细胞间黏附消失,这也是抗原提呈的必要条件。有研究发现HPV16E6/E7癌蛋白可直接抑制了E-cadherin的表达。环氧化酶2(Cyclooxygnasis-2, COX-2)、膜结合型前列腺素E2合酶(Membrane type combined with prostaglandin E2synthetase, mPGEs-1)均为前列腺素E2(Prostaglandin E1, PGE2)合成过程中重要的酶,两者都具有抑制免疫功能的作用。COX2、mPGEs-1都是定位在微粒体膜上,两者相偶联,特别是在前炎症因子的刺激下,共同介导PGE2合成的明显增加。PGE2能引起免疫抑制,能诱导产生抑制性T细胞和抑制性巨噬细胞,还可抑制DC前体细胞向成熟DC转化。最近也有国外研究发现COX2、mPGEs-1可影响抗原提呈细胞的功能。核因子-κB受体活化因子(Receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK)、核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nu-clear factor-kappa B ligand, RANKL)均为肿瘤坏死因子超家族成员。近期有国外研究发现两者在调节DC功能有很重要的作用,包括可提高DC激活T细胞的能力、增加前炎症细胞因子的产生、延迟细胞存活等。RANKL已经被证明在外周血中可维持树突状细胞的存活,另外还可促进许多类型细胞的增殖和分化。人上皮KC细胞可表达RANKL, LC细胞表面可表达RANK。Barbaroux JB的研究第一次报道了RANKL是上皮LC细胞分化和存活的一个重要调节因子。因此,两者与抗原呈递的关系也待进一步探求。本研究筛选仅有低危型HPV (HPV6. HPV11)感染引起的尖锐湿疣局部皮损为研究对象。一方面选择了TLRs及其信号通路相关基因：TLR3、TLR7、TLR9; IRF3、IRF7、TRIF。另一方面选择了6个同抗原呈递相关的基因即：CXCL12、 E-cadherin、COX2、mPGEs-1、RANK、RANKL。应用实时荧光定量PCR检测上述目的基因在低危型HPV感染局部皮损中的表达,以探求其表达的意义,探讨这些相关基因在HPV影响局部免疫可能的作用机制。研究方法从临床收集43例尖锐湿疣标本,使用21种人乳头瘤病毒亚型核酸扩增分型的试剂盒,应用DNA-PCR扩增和导流杂交技术来检测感染HPV型别,筛选出低危型HPV(6、11)27例；以18例正常成人包皮内板组织作为正常对照组。采用Trizol法提取尖锐湿疣组和正常对照组标本的总RNA后,逆转录为cDNA,应用实时荧光定量PCR、SYBR Green染料法进行检测；以β-actin为内参基因,检测TLR3、TLR7、TLR9、IRF3、IRF7、TRIF、CXCL12、E-cadherin、mPGEs-1、 COX-2、RANK. RANKL等13个基因在两组标本中的表达水平。相对基因表达水平计算使用2-ΔΔCt方法,将所得数据经SPSS13.0软件进行统计学处理,采用Mann-Whitney U方法,显著性水准α=0.05。研究结果43例尖锐湿疣标本中,HPV6感染1例(2.32%,1/43例),HPV11感染8例(18.60%,8/43例),HPV6+11感染13例(41.86%,18/43例),HPV6+其它(除HPV11外)感染1例(2.33%,1/43例),HPV11+其它(除HPV6外)感染3例(6.98%,3/43例),HPV6+11+其它感染12例(27.90%,12/43例)。筛选出低危型HPV(6、11)27例、低危型HPV(6、11)的感染率为62.79%。内参基因β-actin在尖锐湿疣标本组和正常包皮对照组中表达相对恒定(P>0.05),差异无统计学意义。TLRs信号通路相关的基因中IRF7在尖锐湿疣组和正常对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),在尖锐湿疣组中表达上调,改变倍数为正常对照组的10.083倍。TLR3、TLR7、TLR9、IRF3、TRIF等(P>0.05),差异无统计学意义；与抗原提呈相关基因中,CXCL12、mPGEs-1(P<0.05),在尖锐湿疣组和正常对照组之间差异均具有统计学意义,CXCL12在尖锐湿疣组织中表达下调,改变倍数为20.231倍；mPGEs-1表达下调,改变倍数为3.233倍。E-cadherin、COX2、RANK、RANKL等(P>0.05),差异无统计学意义。结论本研究中所检测的43例尖锐湿疣标本中低危型HPV感染为100%；43例尖锐湿疣标本中62.79%(27例)为HPV6和11型别单一或混合感染,说明低危型HPV(6、11)是导致尖锐湿疣的主要HPV型别。根据实时荧光定量PCR检测结果,TLR3、TLR7、TLR9同抗病毒相关密切的TLRs在尖锐湿疣组中表达有下调趋势,推测HPV感染抑制TLRs的表达。TRIF. IRF3、IRF7为上述TLRs信号通路下游关键因子,均为上调趋势,其中IRF7在尖锐湿疣组中表达明显上调,提示HPV感染后,机体可激活了NF-κB通路,下游产生Ⅰ型、Ⅱ型干扰素从而启动机体固有免疫并为获得性免疫途径的激活提供必要的条件。低危型HPV(6、11)的感染同TLRs极其下游通路有密切关系,由于TLRs信号通路较为复杂,需要我们今后进一步的深入研究。本研究同时检测了同抗原呈递相关的6个基因：CXCL12、E-cadherin、 mPGEs-1、COX-2、RANKL、RANK。其中,CXCL12及mPGEs-1在尖锐湿疣局部皮损中有明显的表达异常,抑制了局部CXCL12的表达,导致抗原提呈障碍,从而抑制了LC的成熟、迁移；mPGEs-1表达受抑制,PGE2的合成障碍,影响机体免疫反应。根据各个基因的表达异常,结合其功能分析,结果提示低危型HPV(6、11)可能影响TLRs极其下游通路,也影响了机体抗原提呈过程,从而抑制或推迟机体的免疫应答,导致HPV的持续感染和临床上复发。有部分检测的目的基因在尖锐湿疣局部皮损中表达异常,但差异无统计学意义,是否与样本量较少有关或者受其他因素影响,需要我们今后进一步的研究。