基于微流控技术的融合细胞检测与分离方法研究

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细胞分选是指从大量非均一细胞群体中获取性质均一的目标细胞的一种技术,如从大量红细胞中分选其中含有的少量白细胞,从细胞融合液中将融合细胞从未融合细胞中分离出来等,这些对于细胞生物学和临床医学都具有重要意义。目前,融合细胞的分离还只能采用落后的人工方式(容易损伤细胞且效率低下)或者利用价格昂贵而且细胞用量大的流式细胞仪来进行,这些对细胞融合技术的广泛应用都有严重阻碍作用。   因此,本文运用MEMS技术及微流控芯片分析技术来研究一种融合细胞无损分离方法,在此基础上建立了集微流体聚焦、微粒(细胞)光学检测与微粒(细胞)分离于一体的融合细胞分离系统。该检测与分离系统能够在单一微流控芯片上完成细胞排队、光学检测、目标细胞的分离等功能。其工作原理是利用微流体的层流流动特性及微流控制中的鞘流理论,将微粒(细胞)聚集于流动通道中央特定位置,再基于细胞光散射原理,利用光学检测系统,检测出细胞种类;然后利用电场产生的电渗力控制包裹着目标细胞的液体的流动方向,将目标细胞收集到预定的储液池中。   具体而言,论文主要完成了以下几部分工作:   ①理论研究及仿真计算。   论文根据微流控理论,对微芯片中流体的流动进行了理论研究及CFD数值仿真,研究了在两侧鞘流作用下,中间样品流的聚焦宽度与鞘流及样品流的流速比之间的关系,数值仿真结果与理论相互印证;同时,还对鞘流沟道与样品流沟道之间不同夹角时聚焦流的流动进行了数值仿真,根据仿真结果设计了最适合进行无损细胞分离的芯片结构。   ②设计制作检测与分离芯片。   选择不同的材料制作了光学检测与分离芯片,并根据库尔特(Coulter)理论设计制作了阻抗检测芯片;尝试采用多种方法制作微芯片及芯片加工所需的母板(如硅基SU-8光刻),并比较了各种制作方法的优劣,根据实际加工条件最终选择了利用PCB来制作检测及分离芯片的母板;采用二次模塑法成功制作了适合多种细胞分离的通用PDMS芯片,实现了宏观进样与微观进样之间无粘胶剂的自然衔接。   ③组建检测及分离系统。   论文组建了光学检测系统,将光纤集成在芯片上,自动对准后直接传送激光信号并接收细胞的前向散射光,简化了光学系统;利用光电探测器将反映细胞大小的前向散射光转化为电信号并用数据采集器采集该信号;自制暗盒,将芯片、光电探测器等固定于暗盒中,避免杂散光干扰;用自编的软件根据采集到的光电信息的大小控制分离信号以产生合适的电渗力;利用电渗力作为驱动力促使目标细胞偏转,流向设定的储液池。   论文根据Coulter原理(细胞通过微孔时会引起微孔两端电极之间阻抗的变化,其阻抗变化大小与细胞大小相关)搭建了阻抗检测装置,通过测试电极之间的阻抗变化而得到与细胞大小相关的信息。   ④完成聚焦流实验、细胞阻抗检测实验、微粒(细胞)光学检测与分离实验。   利用有色液体进行了聚焦流实验,利用标准微粒进行了排队实验,这两组实验结果证明液流聚焦理论与CFD数值仿真是互相吻合的,论文拟采用的分离方法是可行的。   对小鼠成骨细胞和HEK-293细胞进行了阻抗检测实验,结果表明,细胞通过微沟道时两端电极之间的电阻变化值虽然能反映细胞的大小,但在目前的实验条件下电阻值波动太大,不适合作为分离的依据。   论文利用标准微粒和各种细胞(烟草原生质体、HEK293、酵母菌)进行了光学检测及分离实验,实验结果表明,细胞体积相差不大的情况下,系统能正确地检测出细胞的大小,并将融合细胞分离出来;最后,论文对烟草原生质体的融合细胞进行了分离实验,能在误差允许的范围内将融合细胞分离出来。
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