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[研究目的]肝癌是我国常见的恶性肿瘤。对于中晚期肝癌,单一的手术治疗效果并不理想。吴孟超院士一直倡导中晚期肝癌需要综合治疗。而过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy, ACI)是肝癌综合治疗的方法之一,因其具有特异高效的抗肿瘤作用而在肝癌综合治疗中日益受到重视。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)是过继免疫治疗中主要的效应细胞。因此,获得大量具有高抗瘤活性的TIL是过继免疫治疗的关键。虽然目前制备扩增TIL的方法能得到大量细胞,但仍存在缺陷。例如不能选择性扩增抗瘤活性强的TIL群体等。针对此问题,本研究试图建立一种TIL的寡克隆培养方法从肝癌组织中选择性扩增抗瘤活性强的TIL细胞群,并对TIL的抗瘤活性与调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)之间的关系进行研究,为寡克隆肝癌浸润淋巴细胞的培养扩增提供理论依据及实验基础。[研究内容与方法]1、寡克隆肝癌浸润淋巴细胞分离、培养和鉴定：在新鲜肝癌组织的不同部位取直径约2 mm的肿瘤组织块,取材范围包括肿瘤中心至肿瘤交界区域(肿瘤与正常组织交界线内外2 mm范围)。将组织块置于24孔板中,加入特定培养基,5%CO2条件下37℃恒温培养。2 w后,应用酶免疫测定法(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)检测扩增的各个寡克隆TIL释放的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)浓度,鉴别不同寡克隆TIL的抗肿瘤活性。2、Treg在肿瘤组织中的分布特征：应用免疫组化方法(immunohistochemistry,IHC)检测肝癌组织内FoxP3+Treg的分布及密度,并对实验数据进行统计学处理。3、寡克隆TIL中Treg比例与TIL抗肿瘤活性的关系：应用ELISA及流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测寡克隆TIL中IFN-γ分泌水平及Treg比例,并对实验数据进行统计学处理。4、寡克隆TIL中Treg的比例与培养时间的关系：对寡克隆TIL进行序贯培养观察,分别于培养2 w、3 w、4 w、5 w后收集细胞,通过流式细胞术检测TIL中Treg的比例,并对实验数据进行统计学处理。[实验结果]1、寡克隆肝癌浸润淋巴细胞的分离培养在寡克隆TIL培养过程中,TIL逐渐游走出肿瘤组织块,并在肿瘤组织块周围形成一个密集的淋巴细胞群。随着培养时间的延长,淋巴细胞数量不断增多。大约培养2 w后,TIL的数量可达到1.2×106／ml,此时可见24孔板各培养孔中淋巴细胞汇合。2、Treg在肿瘤组织中的分布特征免疫组化染色结果表明,FoxP3+Treg细胞在整张组织切片中分布不均匀。在肝癌组织中大量分布于肿瘤间质,而在癌旁组织内分布稀少,且呈零散分布。肿瘤实质内单个高倍视野Treg数目为34.32±6.24,肿瘤周边非瘤组织内单个高倍视野Treg数目为4.32±2.66。肿瘤内部与癌旁区域的Treg数目存在显著差异(P=0.009<0.05)。3、TIL中Treg比例与TIL抗肿瘤活性的关系IFN-γ是由TIL释放的具有肿瘤杀伤作用的主要细胞因子,其含量与TIL抗肿瘤活性呈正相关。因此检测寡克隆TIL中IFN-γ的释放量便可分析其抗肿瘤活性的强弱。检测结果表明,TIL中Treg所占比例与TIL的IFN-γ释放量成负相关性(P<0.001),相关系数为-0.650。4、寡克隆TIL中Treg的比例与培养时间的关系通过流式细胞术检测序贯观察不同培养时间的TIL中Treg的比例,培养2 w、3w、4w、5 w的TIL中Treg比例分别为5.55±2.11%、1.81±1.1%、0.44±0.39%、0.23±0.19%。结果显示,与培养2 w相比,培养3 w的TIL中Treg所占比例明显下降(P<0.001),培养4 w和3 w相比,TIL中Treg所占比例明显下降(P=0.001),但4 w和5 w的TIL中Treg所占比例的差别不具有统计学意义(P=0.148)。[结论]1、TIL中Treg比例与TIL抗肿瘤活性成反比。Treg亚群影响寡克隆肝癌浸润淋巴细胞抑瘤活性。2、体外培养TIL过程中,Treg所占比例随着培养时间的延长而下降。3、寡克隆肝癌浸润淋巴细胞培养法可以选择性培养扩增抗肿瘤活性强的TIL。