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第一部分TIPE2对小鼠CD4+T淋巴细胞凋亡的影响及其相关途径目的:分离培养正常小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,将携带TIPE2-小RNA干涉(siRNA)/TIPE2-RNA(沉默/过表达TIPE2)的慢病毒载体转染至CD4+ T淋巴细胞,抑制/过表达T淋巴细胞内TIPE2基因/蛋白表达,观察抑制/过表达TIPE2后CD4+T淋巴细胞凋亡的变化,进一步探讨TIPE2对小鼠CD4+T淋巴细胞凋亡的影响及其相关信号途径,旨在围绕TIPE2寻求和筛选调控CD4+T淋巴细胞凋亡过程,分析TIPE2是否通过线粒体信号途径调控T淋巴细胞凋亡。方法:体外分离、培养正常Balb/c小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞,将携带TIPE2-siRNA/TIPE2-RNA的慢病毒载体(沉默/过表达TIPE2)转染至CD4+T淋巴细胞,抑制/过表达CD4+T淋巴细胞内TIPE2基因/蛋白的表达,①CD4+T淋巴细胞凋亡检测:应用荧光标记Annexin-V/PI双染色法检测T淋巴细胞凋亡情况;②应用Western blot技术检测CD4+T淋巴细胞中凋亡相关分子Smad2/Smad3、磷酸(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2家族蛋白Bcl-2/Bim的表达;③流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞线粒体膜电位改变情况;④共聚焦显微镜检测细胞色素C的变化;⑤化学比色技术分析CD4+T淋巴细胞中耽天蛋白酶(caspase)-3、caspase-8和caspase-9活化情况,并对各组数据进行统计学分析。结果磁珠分选法分离小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞纯度高,TIPE2干扰和过表达慢病毒转染效率较高,Western Blot结果显示,TIPE2基因沉默使小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞TIPE2蛋白表达明显下调,TIPE2基因过表达使小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞TIPE2蛋白表达明显上调。TIPE2组CD4+T凋亡率最高,而siTIPE2组CD4+T调亡率显著低于除normal组外其余3组(P<0.05)。siTIPE2组Smad2/Smad3无明显降低,P-smad2/P-Smad3 表达显著降低(P<0.05)。TIPE2 组 Smad2/Smad3 较其余组升高,但无统计学意义,P-smad2/P-Smad3表达较其余组显著升高(P<0.05)。siTIPE2组Bcl-2的表达较其余组升高(P<0.05),Bim的表达降低(P<0.05)。TIPE2组反之。siTIPE2组线粒体膜电位较normal组外其余组比较升高(P<0.05)。TIPE2组CD4+T内线粒体膜电位较其余组降低(P<0.05)。siTIPE2组细胞色素C水平较除normal组外各组降低(P<0.05);TIPE2组细胞色素C水平较其余组升高(P<0.05)。siTIPE2组CD4+T内caspase3 较除 normal 组外组降低(P<0.05),caspase8、caspase9 活性较其余组降低(P<0.05)。TIPE2 组 caspase 3、caspase 8、caspase 9 活性较其他组均升高(P<0.05)。结论TIPE2基因沉默表达后,小鼠脾CD4+ T淋巴细胞Smad2/Smad3活化减少,并降低CD4+ T内促调亡蛋白Bim表达,促进抗调亡蛋白Bcl-2表达,减少了细胞色素C释放和caspase家族活性,从而抑制了小鼠脾CD4+ T淋巴细胞的凋亡,提示TIPE2可能通过调节CD4+T细胞线粒体膜开闭,释放凋亡基因参与CD4+T淋巴细胞的凋亡过程。第二部分TIPE2对严重烫伤后小鼠CD4+ T淋巴细胞凋亡的影响目的:通过尾静脉注射携带TIPE2-siRNA/TIPE2-RNA(沉默/过表达TIPE2)慢病毒载体,待表达稳定后复制小鼠重度烧伤延迟复苏模型,观察严重烫伤后TIPE2不同处理方式下CD4+T淋巴细胞凋亡的变化情况。从整体水平探讨TIPE2对脓毒症小鼠CD4+ T淋巴细胞凋亡的影响及其与线粒体凋亡信号途径活化间的相关性。方法:成年雄性BALB/C小鼠分为6组:burn组,假伤组(Sham),沉默TIPE2组(siTIPE2-burn),沉默病毒对照组(siTIPE2-negative-burn),过表达 TIPE2 组(TIPE2-burn),过表达病毒对照组(TIPE2-negative-burn)。应用小RNA干扰和过表达技术(siRNA)沉默和过表达TIPE2表达,通过尾静脉分别注射携带siTIPE2/过表达和对照慢病毒,待2周后表达稳定后复制小鼠重度烫伤模型,24h时间点处死。采用MiniMACS免疫磁珠法分选系统分离BALB/c小鼠脾脏CD4+T细胞,采用流式细胞术测CD4+T淋巴细胞凋亡,应用Western blot技术检测各组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中凋亡相关分子Smad2/Smad3、磷酸(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2家族蛋白Bcl-2/Bim的表达;流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞线粒体膜电位改变情况;共聚焦显微镜检测细胞色素C的变化;化学比色技术分析CD4+T淋巴细胞中胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-8和caspase-9活化情况,并对各组数据进行统计学分析。结果在严重烫伤模型小鼠脾脏CD4+T调亡率中,TIPE2-burn组凋亡率最高,而 siTIPE2-bum 组 CD4+T调亡率低于 sham 组外各组(P<0.05)。burn 组 Smad2/Smad3磷酸化明显增强,siTIPE2-burn组Smad2/Smad3无明显降低,P-smad2/P-Smad3表达显著降低(P<0.05)。TIPE2-burn 组 Smad2/Smad3 较 sham 组明显升高(P<0.05),P-smad2/P-Smad3表达较其余组显著升高(P<0.05)。siTIPE2-bum组Bcl-2的表达升高,Bim的表达则降低(P<0.05)。TIPE2-burn组反之。siTIPE2-burn组线粒体膜电位较sham组外其余组比较升高,细胞色素C水平较除sham组外降低(P<0.05);TIPE2-burn组CD4+T内线粒体膜电位较其余组降低,TIPE2-burn组细胞色素C水平有所升高(P<0.05)。siTIPE2-burn 组 CD4+ T 内 caspase 3 较 TIPE2-burn 组降低(P<0.05),caspase8、caspase9 活性较其余组降低(P<0.05)。TIPE2-bum 组 caspase 3、caspase 8、caspase 9 活性较其他组均升高(P<0.05)。结论:沉默TIPE2基因表达后,Smad2/Smad3磷酸化有所抑制,促进Bcl-2的表达,降低Bim的表达,使线粒体孔道开放减少,从而减少细胞色素C外流及caspase活化,降低脓毒症小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞的凋亡率。反之,TIPE2促进脓毒症小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞的凋亡。第三部分TIPE2对健康人外周血CD4+T淋巴细胞凋亡的影响目的:分离培养健康人外周血CD4+T淋巴细胞,经过转染病毒载体沉默/过表达细胞TIPE2后,检测外周血CD4+T淋巴细胞凋亡的变化,分析TIPE2对人体CD4+T细胞凋亡途径的影响与可能机制。评价其临床意义和实用价值。方法:成年健康人分为5组:正常组(normal),siRNA-TIPE2组(siTIPE2),siRNA-TIPE2 对照组(siTIPE2-negative),TIPE2 过表达组(TIPE2),TIPE2 过表达对照组(TIPE2-negative),采用MiniMACS免疫磁珠法分选系统分离人外周血CD4+T细胞,经过转染病毒载体沉默/过表达TIPE2后,采用流式细胞术测CD4+T淋巴细胞凋亡,Western blot技术检测各组CD4+T淋巴细胞内Smad2/Smad3、磷酸(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2家族蛋白Bcl-2/Bim的表达。流式细胞术检测各组CD4+T内线粒体膜电位改变情况,共聚焦显微镜检測细胞色素C的变化,化学比色法检测各组CD4+T淋巴细胞内caspase3、caspase8、caspase9的活化情况。结果CD4+T调亡率TIPE2组凋亡率最高,正常组次之,siTIPE2组CD4+T调亡率最低(P<0.05)。siTIPE2 组 Smad2/Smad3 无明显降低,P-smad2/P-Smad3 显著降低(P<0.05)。TIPE2 组 Smad2/Smad3 较其余组升高,P-smad2/P-Smad3 表达较其余组显著升高(P<0.05)。siTIPE2组Bcl-2的表达较其余组升高,Bim的表达降低(P<0.05)。TIPE2组反之。siTIPE2组线粒体膜电位较其余组比较升高,细胞色素C水平降低(P<0.05);TIPE2组CD4+T内线粒体膜电位较其余组降低,细胞色素C水平升高(P<0.05)。siTIPE2 组 CD4+T 内 caspase 3、caspase 8 和 caspase 9 活性较其余组均降低,TIPE2组caspase 3、caspase 8、caspase 9活性较其他组均升高(P<0.05)。结论沉默TIPE2基因表达后,降低了人外周血CD4+T淋巴细胞Smad2/Smad3磷酸化,降低CD4+ T内促调亡蛋白Bim表达,促进抗调亡蛋白Bcl-2表达,降低线粒体膜通透性,减少降低了细胞色素C释放及caspase家族的活化,从而抑制人CD4+T淋巴细胞的凋亡。