第一部分 NOS在颅内动脉瘤发病机制中的作用研究研究背景：颅内动脉瘤(Intracranial Aneurysm, IA)是动脉管壁病理性局限性扩张产生的脑血管瘤样突起,其破裂是引起人类自发性蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage, SAH)最常见的原因。IA的发病率在我国脑血管意外中排第三位,仅次于缺血性脑卒中和高血压脑出血。该病诊治的难点在于临床症状隐匿,大多数在破裂后才被发现,致死率和致残率极高。目前对于IA无理想的早期预防和筛查手段,是由于该病的病理学改变及发病机制尚未完全明确。最近的研究表明,受损动脉壁在血流动力学改变与炎性反应的共同作用下暴露出一些抗原分子,引发分子水平上的一系列的级联反应,最终导致动脉壁降解,引起IA的形成及破裂。其中一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)在这一分子级联反应中发挥重要作用。目前已有动物实验表明IA模型中存在特征性的病理学及NOS表达水平的改变,由于人体IA标本难于获取,尚缺乏活体动脉瘤标本的病理学及NOS表达水平研究。如果能发现人体动脉瘤标本中NOS明显改变,则可以证实NOS可能在IA形成过程中发挥重要作用,将对IA的早期预防和筛查具有重要意义。众多的研究表明,在IA形成和破裂过程中,除了NOS外尚有大量的细胞因子及炎性介质等蛋白分子的表达及活性均会发生改变。因此,在这些纷繁复杂的细胞因子和蛋白分子相互作用网络中,筛选出一些相对重要的枢纽环节或关键因子,明确它们在IA病理生理中的调控作用,就可能成为IA发病机制研究的突破口。以同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)技术为基础的定量蛋白质组学方法是近年来发展起来的一种高通量蛋白分子筛选方法,是目前差异表达蛋白分子筛选最强有力的工具。本研究拟对手术获取的脑动脉瘤标本进行常规病理检查,观察动脉瘤壁的病理学变化及超微结构改变；通过免疫组化方法检测NOS在动脉瘤标本内表达情况；同时通过iTRAQ技术筛选动脉瘤标本中差异表达蛋白分子,探讨它们在动脉瘤形成和破裂中可能的作用,为进一步阐明动脉瘤发病分子机制提供依据,同时也为动脉瘤生物学治疗的发展奠定基础。目的：观察动脉瘤的病理学及超微结构改变,检测NOS在颅内动脉瘤中的表达,通过iTRAQ技术筛选动脉瘤差异表达的蛋白分子,探讨它们在动脉瘤形成和破裂中可能发挥的作用,为进一步阐明动脉瘤发病分子机制提供依据。方法：选取山东大学齐鲁医院及潍坊市人民医院神经外科2012年5月～2014年11月神经外科手术夹闭的脑动脉瘤标本,同时以颅脑外伤手术患者头皮断裂的颞浅动脉(Superficial Temporal Artery, STA)及皮层动脉作为对照,1.用常规光镜、电镜观察IA及正常血管的病理形态学变化及超微结构改变。2.免疫组化SABC法测定动脉瘤中诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS)表达水平,同时测定动脉瘤标本中NOS蛋白含量。3.iTRAQ技术筛选颅内动脉瘤标本中差异蛋白分子。结果：1.动脉瘤的病理变化：HE结果显示动脉瘤典型的三层结构消失,内膜连续性中断,内弹力板较薄,消失或中断,内皮细胞变性或坏死。中膜平滑肌细胞少见,细胞外基质破坏严重,并见大量炎性细胞浸润,其中以巨噬和中性粒细胞为主。电镜超微结构观察显示动脉瘤内皮细胞损伤、坏死,可见细胞固缩或空泡变性；中膜正常内部结构消失,细胞外基质模糊不清,平滑肌细胞坏死,部分见凋亡小体；瘤壁可见炎性细胞浸润,主要为巨噬细胞。而对照组动脉的结构是正常的,内皮细胞完整、均匀,中膜内平滑肌纤维排列有序、密集,基质纤维清晰可见,并没有发现炎症反应。2.NOS表达：iNOS在25例对照组标本中23例无表达(23/25),2例弱表达(2/25),36例动脉瘤组中6例中表达(6/36),30例强表达(30/36),动脉瘤组iNOS表达水平与对照组相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。动脉瘤组iNOS含量为13.3129±2.4581 U/mg蛋白,对照组为7.5623±2.0321 U/mg蛋白,iNOS在动脉瘤组明显增高,有统计学意义(P=0.032<0.05)。动脉瘤组总一氧化氮合酶(Total NOS)为24.5631±6.5684U/mg蛋白,对照组为22.1325±6.1358 U/mg蛋白,差异无统计学意义(P=0.562>0.05)。动脉瘤组中iNOS/TNOS之比明显升高,差异有统计学意义(P=0.039<0.05)。3.iTRAQ结果：通过iTRAQ技术共鉴定出有定量信息的蛋白分子816个,与对照组相比,差异2倍以上的有162个,包括80个上调蛋白和82个下调蛋白,其中与细胞外基质降解有关的基质金属蛋白酶-9(Matrix MetalloProteinase, MMP-9)上调3.7倍。上调蛋白主要是炎性反应相关蛋白,其次是细胞迁移、侵袭和细胞免疫补体复合物蛋白；除细胞骨架连接蛋白外,下调蛋白较多的是在内皮细胞迁移、增殖以及信号传导中发挥重要作用一类蛋白。结论：1.动脉瘤的病理及超微结构改变主要是内皮细胞坏死及炎症细胞浸润,特别是单核巨噬细胞,平滑肌细胞凋亡,细胞外基质破坏,提示内皮细胞坏死及炎症细胞特别是巨噬细胞浸润在动脉瘤壁病理改变中发挥重要作用。2.动脉瘤标本中以iNOS为主的NOS的表达增高说明,iNOS可能在动脉瘤发生发展过程中发挥重要作用。3.破裂动脉瘤有多种蛋白分子表达异常,它们可能参与了动脉瘤形成和破裂的分子机制。4.颅内动脉瘤的形成是由NOS介导的多种蛋白分子参与的复杂过程。第二部分颅内多发动脉瘤个体化治疗研究研究背景：颅内多发动脉瘤(Multiple Intracranial Aneurysms, MIAs)是指颅内同时存在2个或2个以上的动脉瘤。与单发性颅内动脉瘤(Single Intracranial Aneurysm, SIA)相比,破裂机会更多,诊治更加复杂,预后更差。MIAs发病率约占颅内动脉瘤的5%-30%,其检出率随着影像学尤其是3D-CTA、 3D-DSA的发展不断提高,处理MIAs将成为颅内动脉瘤治疗的重点。目前对于MIAs临床治疗措施,尚未达成一致意见,争议主要存在以下四个方面：一是MIAs中未破裂动脉瘤(Unruptured Intracranial Aneurysms, UIA)手术还是保守治疗；二是血管内治疗还是显微外科手术治疗；三是一期还是分期手术治疗；四是已发生脑血管痉挛的情况下手术时机的选择。颅内镜像动脉瘤(Mirror Aneurysms, MAs)是MIAs的一种特殊类型,指位于两侧对称位置的动脉瘤,由于其空间分布的特殊性,临床治疗较棘手。本文回顾性分析了我科收治经外科治疗的106例MIAs(包括37例MAs)患者的临床资料,多因素回归分析影响MIAs预后的临床因素,总结我科治疗经验,为MIAs个体化治疗策略的制定提供参考。目的：探讨MIAs及MAs的个体化治疗方案及MIAs患者的预后影响因素。方法：回顾分析2007年1月-2015年12月潍坊市人民医院神经外科收治的经外科手术治疗的106例MIAs(共232枚动脉瘤,其中包括37例MAs)患者的完整资料。根据患者具体情况,按照治疗措施分为三组,显微手术、介入栓塞、介入栓塞和显微手术联合治疗；按照治疗的时机分为仅处理责任动脉瘤,一期及分期处理动脉瘤三组。106例MIAs中开颅夹闭58例,介入栓塞44例,手术联合介入4例；其中39例仅处理责任动脉瘤,一期治疗53例,分期处理14例。37例MAs开颅夹闭21例,介入栓塞15例,手术联合介入1例；其中18例仅处理责任动脉瘤,一期治疗13例,分期处理6例。探讨的术前临床因素包括：患者性别、年龄、动脉瘤部位、侧别、数量、术前Fisher分级、Hunt-Hess分级、治疗措施、处理时机。出院时G08评分评估术后疗效。分别应用单因素分析及多因素Logistic回归分析术前各因素、治疗方案对治疗效果的影响。结果：出院时MIAs患者GOS评分5分75例,4分10例,3分9例,2分4例,1分8例。预后良好(4-5分)85例,差(1-3分)21例。MAs患者出院时GOS评分5分31例,4分2例,3分3例,2分0例,1分1例。预后良好(4-5分)33例,差(卜3分)4例。各治疗组GOS评分：介入44例中,良好37例,差7例；手术58例中,良好45例,差13例；介入+手术4例中,良好3例,差1例。MIAs患者年龄、部位、术前Fisher及Hunt-Hess分级经单因素分析显示与预后相关(P<0.05),患者年龄越大,预后越差,动脉瘤位于后循环预后差,术前Fisher及Hunt-Hess分级级别越高,预后越差。多因素Logistic回归分析结果显示MIAs患者各因素中年龄、部位及Fisher分级与预后相关(P<0.05)。结论：MIAsI临床多见,而MAs少见,二者均多见于后交通动脉,主要依靠DSA诊断,应在诊断全面的基础上,正确判断责任动脉瘤并早期积极治疗,对于非责任病灶需要综合评估出血风险,采取个体化治疗措施,尽量一期治疗所有动脉瘤,减少再出血风险。患者年龄、部位、术前Fisher和Hunt-Hess分级是影响MIAs患者术后疗效的关键因素。根据患者的实际情况选择开颅手术、介入栓塞或开颅手术+介入栓塞等个体化治疗方案是改善MIAs患者预后的关键。