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目的:通过RANKL定向诱导RAW264.7细胞为破骨细胞的方式建立破骨细胞模型,并对该细胞进行鉴定:由于硼替佐米可以通过影响骨髓瘤细胞介导细胞因子表达而间接影响到破骨细胞的分化成熟和功能,为进一步探讨其直接影响破骨细胞的分化的作用,并对破骨细胞的标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活力进行测定以观察硼替佐米对破骨细胞功能影响。 方法:1、把RAW264.7细胞以1×105/ml的密度接种于培养瓶内,预先将紫外照射过的圆形玻片置于48孔板,设置5-6个复孔,是培养过夜后(细胞附上玻片),倒去培养液,换200μl的50 ng/ml的RANKL诱导,细胞每3 d换液1次。第3、6、9天分别取出圆玻片,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒染色,光镜下观察多核细胞的形态学及组织化学特点。2、观察在小鼠破骨细胞株体外诱导分化成熟过程中,硼替佐米对其分化和功能的影响。在诱导向破骨细胞分化过程中,采用 A组和 B组骨板骨吸收情况对比的方法:A组和 B组的细胞密度为105/ml,A组的RAW264.7用100ng/ml的RANKL诱导分化,3天换液1次;B组的细胞培养基里除了含有100ng/ml的RANKL,还有10.0nM/ml的硼替佐米,3天换液1次,第14天观察到骨片上骨陷窝的,与对照组比较,得出结论。3、将细胞以1*105的密度铺在48孔培养板上,设5个复孔,培养过夜后,换含有sRANKL和硼替佐米的培养液共同培养,使RANKL的浓度为50ng/ml,硼替佐米浓度分别为0.1nM/ml,1nM/ml,10nM/ml,培养9天后取上清液待测。用抗酒石酸酸性磷酸酶测试盒测量OD值并计算出活性值, 结果:1、诱导培养3天后可见少量活性良好的破骨样细胞,胞质内可见透亮区,且胞质内含许多红色阳性颗粒,此为TRAP染色(十)颗粒,细胞内可见淡染的双核,三个核以上的细胞未观察到。诱导培养6天后可见大量TRAP染色(+)破骨样细胞,此时细胞核仍以双核为主,可见少量多核细胞。诱导培养9天后出现多核巨型TRAP染色(+)破骨样细胞,细胞较第3,6天明显增大,细胞核可达到3个以上。2、通过A组和B组骨吸收面积对比,发现硼替佐米干预的B组面积明显少于无硼替佐米干预的A组。3、硼替佐米降低了小鼠破骨细胞中的trap活性。TRAP是破骨细胞标志物,它的降低说明硼替佐米可以抑制破骨细胞成熟,减少破骨作用。 结论:1、RANKL成功地把 RAW264.7细胞定向诱导成为破骨细胞。2、硼替佐米能显著的减少破骨细胞骨质破坏作用。3、硼替佐米可以通过抑制TRAP分泌而达到抑制破骨细胞的骨质破坏作用。