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本研究对PRRSV新型疫苗设计进行了新的探索,构建了以LTb为分子内佐剂的PRRSV-GP5融合蛋白,经动物免疫试验,阐明LTb的分子佐剂作用,为研究新型PRRS疫苗探寻新途径。主要研究内容如下:1.PRRSV ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹将PRRSV ORF5基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET- ORF5,将重组质粒转化到受体菌BL21(DE3)中,并用诱导剂IPTG进行诱导表达,2小时后表达量达到高峰。经15%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的蛋白大小为13.75KD。经Western Blotting分析,表达蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。2.E.coli LTb与PRRSV gp5融合基因克隆,表达与免疫印迹采用PCR重叠延伸技术将LTb和PRRSV ORF5基因通过柔性连接进行融合后,克隆入原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET- LTb-gp5,将重组质粒转化到受体菌BL21(DE3)中,并用诱导剂IPTG进行诱导表达,表达蛋白2小时后表达达到高峰。经15%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的蛋白大小为26KD。经Western Blotting分析,表达蛋白均能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。3.gp5蛋白与LTb- gp5融合蛋白免疫效果的比较将表达产物gp5蛋白及融合表达的LTb-gp5蛋白免疫6-8周龄ICR小鼠,并设对照组用间接ELISA法和MTT法检测小鼠血清中特异性抗体水平以及脾脏中T、B淋巴细胞增殖功能。结果gp5蛋白以肌肉注射途径免疫效果较好;三免后gp5特异性抗体达到较高水平,其中LTb-gp5 IM与gp5+氟氏佐剂组之间差异不显著,而这两组与gp5 IM差异显著;从抗体种类来说,LTb-gp5三免后达到和gp5+氟氏佐剂组相同的三种抗体亚型,而gp5 IM仍然是一种抗体亚型。LTb-gp5 IM、gp5+氟氏佐剂组和gp5 IM均能够诱导脾脏T,B淋巴细胞增殖;LTb-gp5 IM、gp5+氟氏佐剂组均显著高于gp5 IM。4.大肠杆菌LTb蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将大肠杆菌不耐热肠毒素LTb基因去除信号肽后与载体pPIC9K连接,电转化入酵母菌SMD1168中进行诱导表达。用纯化的LTb表达蛋白免疫6周龄BALB/c鼠3次,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合后,以间接ELISA和有限稀释法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗大肠杆菌LTb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1F2,2C2,3D6,4H6株。经Western blotting分析,这几株均能与大肠杆菌LTB表达蛋白产生特异性反应。抗体亚型鉴定结果表明,这四株均为IgG2a型。