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乳糖不耐受症(Lactose intolerance,LI)是指与乳糖不完全消化相关的胃肠道症状,即由于小肠乳糖酶缺乏,牛奶中的乳糖不能被完全分解吸收,从而进入结肠,被肠道细菌分解后,产生大量短链脂肪酸和氢气,造成渗透压升高,使肠腔内的水分增多,引起腹鸣、肠鸣、腹绞痛以及腹泻等症状。乳糖不耐受症的机制尚不清楚,目前,一些研究表明,结肠发酵可能在乳糖不耐受症中起作用,因此,改变结肠细菌以有效代谢乳糖是一种新颖且可能有用的改善乳糖不耐受症的方法。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)是一种水溶性高分子多糖,是魔芋块茎中通过β-1,4-糖苷键连接而成的葡萄糖和甘露聚糖聚合物。KGM经半干法酶解制备得到甘露二糖到甘露十糖的魔芋葡甘低聚糖(konjac oligoglucomannan,KOGM),避免了KGM相对分子量大、黏度高、溶解度小等缺陷。KGM和KOGM作为天然安全的食材,能够广泛的在食品工业中应用,发挥其独特的保健功能作用。临床研究表明,KGM具有缓解便秘,降低超重和肥胖人群的体重,防止糖尿病,降低癌症风险等生理功效,食用KGM对健康有益,是一种优质的益生元。同时,在过去的几十年里,已经有研究表明低聚糖的益生元作用,美国等已有KOGM食品以及功能食品上市。此外,KGM和KOGM可以选择性刺激双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌的生长并促进短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)的产生。双歧杆菌可促进小肠绒毛上皮细胞增生,分泌乳糖酶,肠道内形成“乳糖酶-低聚半乳糖-双歧杆菌”的微生态循环平衡体系,三者具有相互协同作用,维持肠道内的微生态平衡。因此适量的补充双歧杆菌可以改善乳糖不耐受症的发生。本文初步探讨了益生元对改善乳糖不耐受症的作用,以KGM和KOGM为原料,研究其在不同人群粪便菌群中的体外发酵特性,初步验证其对乳糖不耐受症人群的益生作用;进一步通过动物实验,观察KGM和KOGM在小鼠体内的代谢特征及其对小鼠肠道菌群的影响;最后,利用小鼠粪便进行体外发酵实验,反映KGM和KOGM对乳糖体发酵降解特性的影响,来判断KGM和KOGM作为益生元改善乳糖不耐受症的可行性。主要结论如下:(1)结肠发酵对乳糖不耐受症的作用的研究表明:在同一发酵时间段内,健康组和乳糖不耐受组中空白组的发酵液pH值之间没有显著性差异(p>0.05);在发酵第5 h时,乙酸、丙酸和丁酸的浓度在各组间无显著性差异;在发酵的1-3 h之间,健康组和乳糖不耐受组的空白组之间乳酸浓度差异不显著(p>0.05),第3 h后,健康组中空白组乳酸含量较之不耐受组明显增加。培养期间,健康组发酵液中乳酸的产生率高于乳糖不耐受组,而且健康组产生的乳酸含量显著多于乳糖不耐受组(p<0.05)。(2)KGM和KOGM在不同受试者粪便菌群中的体外发酵试验结果表明,KGM和KOGM的添加可有效降低健康组和乳糖不耐受症组发酵液的pH值(p<0.05),促进发酵液中SCFA的产生,并且与健康组人群粪便体外发酵结果相比,KGM和KOGM能促进乳糖不耐受症组人群粪便发酵产生更多的乙酸和丁酸。由此可见,KGM和KOGM对乳糖不耐受症受试者同样具有益生作用。(3)通过测定不同周龄小鼠的小肠乳糖酶活性,选用5周龄雄性KM小鼠作为本实验研究对象是合适的。动物实验结果表明,灌胃KGM和KOGM对小鼠的体重没有显著性影响(p>0.05),且在短时间内(4周)也不会明显提高小鼠小肠乳糖酶活性。但是,小鼠小肠指标的测定结果显示,KGM和KOGM的摄入使小鼠回肠组织变得更完整和健康,显著增加了其绒毛高度和肠壁厚度(p<0.05),同时降低其隐窝深度(p<0.05)。小鼠摄入KGM和KOGM 4周后,脏器指数显著增加(p<0.05),血清和肝脏的总肝固醇(T-CHO)和甘油三酯(TG)含量降低,同时免疫球蛋白G(lgG)值、免疫球蛋白A(lgA)值和血清游离脂肪酸(FFA)值明显提高(p<0.05)。(4)通过对小鼠结肠内容物进行16S rRNA测序,分析了小鼠肠道微生物菌群多样性和丰度的变化。结果表明,药物、KGM和KOGM的摄入显著改善了小鼠结肠肠道微生物菌群的组成和比例,说明KGM和KOGM能够通过促进肠道有益菌群的生长改善结肠发酵从而对乳糖不耐受症症状产生影响,对机体起到有益作用。在门水平,所有样本中优势菌门是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)和变形菌门(Proteobacteria),其相对丰度分别在每个样本中的比例之和大于80%。在属水平,KGM和KOGM显著提高了乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度(p<0.05),同时降低了Bacteroides和Akkermansia丰度(p<0.05)。(5)实验4周后,KGM和KOGM的摄入显著降低了小鼠粪便的pH值(p<0.05),同时提高了小鼠粪便含水量(p<0.05)和粪便SCFA的产量(p<0.05),尤其是乙酸和丁酸。这说明KGM和KOGM对促进肠道健康具有积极作用。选用空白组小鼠结肠内容物进行体外发酵实验,结果表明,在乳糖中加入KGM和KOGM加速了发酵液pH值降低的速率,且pH值最低,同时,显著提高了发酵液中SCFA的产量和乳糖酶活性(p<0.05)。简言之,KGM和KOGM可以为机体提供良好的肠道环境,有效改善小鼠肠道微生物菌群代谢产生SCFA,促进结肠发酵和乳糖酶活性的增加,在改善乳糖不耐受症的益生元制品开发中具有应用潜力。