论文部分内容阅读
背景与目的研究证明各种原因所致的细胞死亡将引发组织细胞的再生与修复，此过程有赖于细胞与其微环境间的信息交流。当病理性的组织损伤与细胞丢失反复发生，组织持续性再生修复的结果则可能产生异常的组织结构如肝硬化、腺上皮增生、异常化生等，原有的正常细胞分化微环境受破坏，从而干扰增殖中的细胞进一步分化成熟或导致异常增殖。我国是肝病高发地区，各种致病因素（病毒、酒精、寄生虫、化学损伤等）的长期存在、反复的炎症活动等引起的慢性肝损伤，最终的发展结局为肝硬化及肝癌，其中必经的病理过程是肝纤维化，因此，肝纤维化微环境下细胞的增殖、分化及其分子调控是理解肝癌发生机制的关键。已有的研究认为肝纤维化是受损肝细胞的凋亡及肝星形细胞（Hepatic StellateCell, HSC）活化两方面相互作用的结果，活化的HSC表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及各种细胞外信号转导通路蛋白，并产生大量以胶原为主的细胞外基质成分和细胞因子，导致肝组织微环境及结构的变化。有多种信号通路与肝纤维化进程有关，其中包括调控细胞增殖及分化的Wnt/β-catenin通路，但其关键效应分子β-catenin在肝纤维化过程中的细胞定位及作用不明了，本研究应用传统的CCl4肝损伤模型及组织学、分子生物学手段动态观察肝纤维化过程中β-catenin的表达特征及定位，以明确肝纤维化过程中β-catenin信号通路活化的细胞类别，探讨其在肝组织结构及细胞微环境病理变化过程中的作用。方法1.动物模型制备：健康雄性昆明小鼠（n=45）随机分为对照组（n=15）与实验组（n=30）。实验组又随机分为损伤1wk组、损伤4wk组、损伤8wk组，实验各组小鼠首次皮下注射CCl4原液（6mL/kg体质量），以后隔3天再次皮下注射50%CCl4-粟米油混悬液（6mL/kg体质量），每周两次；对照组只给予皮下注射同等剂量的粟米油，每周两次。2.实验标本的处理：分别于实验1wk、4wk、8wk末取各组小鼠中叶肝组织，部分置液氮内快速冷冻后提取RNA和蛋白，另一部分置于40g/L中性甲醛固定,常规方法石蜡包埋，制备包含各组小鼠肝脏组织的阵列切片备用。3.实验方法：用常规组织学H&E染色及Masson染色方法，光学显微镜下观察比较肝组织结构病理变化；应用免疫组化、RT-PCR和Western Bloting方法检测肝组织内Desmin、a-SMA、β-catenin的表达的情况并进行统计学分析；应用β-catenin及CK19免疫荧光双标记方法确定β-catenin阳性表达细胞类别，探讨其意义。结果1. H&E染色：对照组肝小叶结构正常，肝细胞无变性坏死；实验组肝脏损伤程度随给药时间的增加而加重，其中1wk组肝组织内可见炎性细胞浸润及少量的细胞坏死；4wk肝组织内有大量的空泡样变，肝小叶间纤维增生较明显，小叶周围汇管区可见增生的细胞团；8wk组肝小叶结构破坏，有大量的纤维间隔包绕肝组织形成假小叶，可见较多的新生胆管。2. Massson染色：对照组肝组织汇管区和血管壁可见少量绿色胶原纤维；实验组肝组织内胶原纤维逐渐增多，8wk组肝组织内胶原纤维显著增生形成间隔,有假小叶形成。3. Desmin表达：免疫组化结果显示，对照组肝内有少量散在的Desmin阳性表达细胞，位于肝血窦周围。实验组随肝损伤时间增加Desmin阳性细胞数增加，各时间点肝组织内Desmin阳性细胞均多于对照组，其中损伤4wk组Desmin阳性程度最高；RT-PCR结果显示，对照组及实验组各时间点均有Desmin mRNA表达，其中损伤各组Desmin表达与对照组相比差异有显著性意义（P﹤0.001），损伤1wk、4wk及8wk各时间点相比差异有显著性意义（P﹤0.001）。4. α-SMA表达：免疫组化结果显示，在对照组中α-SMA仅在血管壁有少量阳性细胞表达，在实验组中，α-SMA阳性表达细胞分布于肝细胞及肝血窦周围，随损伤时间延长α-SMA阳性细胞逐步增多，损伤4wk时达峰值。RT-PCR结果显示，对照组及实验组各时间点均有α-SMA表达，与对照组相比具有显著性意义（1wk vs对照组P﹤0.05、4wk、8wk vs对照组P﹤0.001），1wk、4wk及8wk各时间点相比差异有显著性意义（P﹤0.001），其中4wk组表达量明显高于其它两个时间组。5. β-catenin表达：RT-PCR结果显示，对照组及实验组各时间点均有β-catenin表达，其中损伤1wk时β-catenin表达与对照组相比无明显差别（P>0.05），损伤4wk及8wk时β-catenin的表达明显下降，与对照组相比差异均有显著性意义（P﹤0.01），损伤组之间两两比较结果显示各组差异有显著性意义（P﹤0.01），以4wk组表达最低。Western Blotting检测结果显示各组均有β-catenin蛋白表达，其中损伤1wk时β-catenin表达与对照组相比无明显差别（P>0.05），损伤4wk及8wk时β-catenin的表达明显升高，与对照组相比差异均有显著性意义（P﹤0.001）。免疫组化结果，可见对照组肝细胞及胆管上皮细胞膜有微弱的β-catenin表达，实验组肝细胞膜同样有β-catenin基础表达，此外，在肝血窦内皮、肝内新生细胞团及胆管上皮细胞胞质出现较强的β-catenin表达，个别肝细胞胞质内也可见β-catenin阳性表达，以损伤4wk组β-catenin阳性表达最为明显。6. β-catenin与CK19的免疫荧光双标记：免疫荧光双标记结果显示，对照组肝内有β-catenin及CK19表达，两者共定位于胆管上皮细胞；实验组1wk组肝组织β-catenin与CK19的表达及分布与对照组相同；4wk组肝组织内可见新生细胞团内有β-catenin高表达，与CK19的共定位于新生细胞及胆管上皮细胞的胞质，同时也可见仅表达CK19的胆管上皮细胞；而8wk组肝组织胆管上皮大多表现为β-catenin与CK19共表达。结论1.CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型构建成功。2.CCl4诱导的肝纤维化过程中β-catenin阳性表达主要定位于新生的胆管上皮样细胞团及胆管上皮细胞胞质，其mRNA表达与蛋白表达不同步，提示可能有β-catenin蛋白降解受阻所致的β-catenin胞浆内累积。3.肝纤维化过程可诱导出现胆管上皮样细胞增殖，共表达β-catenin及CK19，归属肝内干细胞（卵圆细胞）。