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老化（ageing）是所有高等生物体一种普遍特性,在酵母和动物细胞中老化通常伴随着端粒缩短、蛋白内稳态丢失及体细胞突变等。在植物中,一些多年生木本植物和灌木的寿命可达成百上千年,然而对于多年生植物老化过程的分子机制研究还很少。维管形成层干细胞（vascularcambium）具有连续分裂能力,不断分裂分化产生木质部和韧皮部,使树木不断增粗。维管形成层的活性受到多方面影响,前人研究主要集中在年周期上,而对其年龄效应的调控机制尚不清楚。银杏（Ginkgo biloba）起源古老,银杏树通常寿命较长,在中国存在很多树龄超过1000年的银杏树,因此,可作为研究多年生树木老化机制的理想材料。本研究以银杏树为研究对象,针对与树木密切相关的形成层干细胞分裂和分化能力,采用细胞学、生理指标测定、分子生物学、生物信息学等实验技术对银杏主干形成层进行研究,主要取得以下结果:（1）根据物候期及形成层细胞层数和大小变化,我们将银杏形成层的年周期活动分为四个阶段:12月至2月上旬为休眠期,形成层带包含4-6层细胞,形成带宽度约为58.79 ±11.67 μm;2月中旬至4月为恢复活动期;4月下旬至10月为活跃期,此时,形成层带细胞层数多达10-12层,形成带宽度为104.58 ±9.77 μm;11月为过渡期。此外,形成层细胞的活跃程度与温度有关,温度最高的7、8月份,形成层细胞最活跃,随着温度降低,其活性也降低。（2）通过透射电镜观察,形成层细胞的细胞壁厚度在活跃期最薄,切向壁厚度约为0.56 ± 0.10 μm,径向壁厚度约为0.23 ±0.03 μm:而在休眠期细胞壁最厚,切向壁厚度达到0.90± 0.33 μm,径向壁厚度为0.66± 0.11 μm。此外,韧皮部细胞内淀粉含量在休眠期较多,而在活跃期几乎观察不到淀粉粒。（3）在对年周期研究的基础上,选取5月份对不同树龄的银杏树进行取样。共选取了34株生长势良好的银杏雌株,钻取年轮条,通过年轮分析确定了这些树的树龄,古树年轮宽度在前200年显著减少,随后的几百年中,呈现缓慢的下降趋势。（4）以不同树龄 15Y（years）、20Y 和 22Y 作为 20 年组（VC20）,193Y、211Y 和 236Y作为200年组（VC200）,538Y、553Y和667Y作为600年组（VC600）,对形成层的生理水平进行测定。IAA含量随树龄增加而显著减少,ABA含量则随树龄增加而显著增加。H202含量在古树中高于20年,POD及SOD活性在20年组中最高,高于古树组,POD活性表现出显著差异,SOD活性差异不显著。（5）对上述选择的9棵树的形成层进行小RNA测序,9个文库都获得了超过11,409,789条原始序列,去除无插入片段,含有5’接头,PolyA/T/C/G等低质量序列后,最终获得了超过11,237,460条干净序列。文库中小RNA长度集中在19-24 nt之间,在21 nt处有峰值,符合典型miRNA的长度分布。（6）比对miRbase之后,共获得了 276和356个已知的和新的miRNA,进一步通过差异分析,发现以VC20为对照,VC200中有89个差异表达miRNA,VC600中有67个差异表达miRNA,以VC200为对照,VC600中有17个差异表达miRNA。对所有miRNA的表达模式进行聚类分析,共获得8种表达模式,其中随年龄增长表达量逐渐增加的miRNA有30个,随年龄增长表达量逐渐下降的miRNA有35个。（7）通过降解组测序共获得16,378,280条降解片段,比对到各类RNA之后,获得cDNAsense序列,与miRbase中的植物miRNA进行比对,最终鉴定出96个miRNA切割203个靶基因位点。（8）通过转录组、小RNA和降解组联合分析发现tcc-miR172d、osa-]miR528-5p、aly-miR165a-3p等13个miRNAs的靶基因功能与细胞分裂分化相关,并且这些miRNAs在VC200和VC600中上调表达,对应靶基因下调表达;尤其,miR166靶向HD-ZIPⅢ家族基因,miR166表达量随树龄的增加而升高,HD-ZIP Ⅲ家族基因则表现出相反的表达模式,降解组测序明确了 miR166对6个靶基因的切割位点,这些结果表明形成层细胞的分裂能力在古树中下降。（9）生长素相关miR160、miR167等在古树中高表达,对应靶基因的表达量随年龄增加而下降,降解组测序鉴定出miR160对其靶基因ARF16家族基因Gb22507、Gb33804和Gb39786的切割位点;细胞分裂素相关的miRNAs和靶基因的表达模式与生长素类似,细胞分裂素响应因子和受体在古树中下调表达。（10）次生代谢相关miR396、novel67等在古树中高表达,对应靶基因在古树中表达量下降,通过降解组测序明确了 miR396b-5p切割Gb20206和Gb11915的位点,以及miR156切割Gb23724的位点。（11）实时荧光定量PCR实验验证了 8个与形成层发育和抗性相关的基因在不同生长时期的表达变化,发现形成层发育相关的miR159和miR166在恢复活跃期表达量较高,而miR164和miR319表达量在活跃期显著升高;抗性相关的miR482和miR2950在休眠期表达量较高,表明这些miRNA可能参与调控银杏形成层的年周期活动。此外我们还挑选了 6个细胞分裂相关基因在更多的年龄段进行表达量分析,发现Gb11201,Gb07568等3个基因表现出较强的年龄效应,在古树中表达量降低。