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植物中,WRKY转录因子家族成员众多,近年来成为植物分子生物学研究的热点。由于其编码蛋白的N-端具有高度保守的WRKYGQK氨基酸残基序列,人们将其命名为WRKY。其保守的WRKY结构域能与下游基因启动子W-box特异性结合,从而调控下游基因的表达水平。目前,诸多研究结果表明,WRKY转录因子在植物中参与生物胁迫、非生物胁迫、种子发育、种子休眠与萌芽、形态建成、衰老等方面的表达调控。前人研究表明,拟南芥转录因子AtWRKY70的表达水平受水杨酸诱导,与该信号途径当中的抗病反应相关联。与野生型相比,超量表达AtWRKY70的拟南芥植株对青花菜褐茎病(Hyaloperonospora parasitica)、假单胞菌(Pseudomonas syringae)等真菌病表现出了更强的抗性,而对欧文氏软腐菌(Erwinia amylovora)等细菌病则更敏感。同时发现,AtWRKY70对植物的衰老起负调控作用。序列对比分析表明,在杨树当中,PtWRKY89与AtWRKY70高度同源,然而,对于PtWRKY89生物学功能的研究至今尚未报道。本论文中,我们首先克隆了PtWRKY89基因,并对其进行了组织表达分析及亚细胞定位,进一步构建载体转化毛白杨,在转基因植株中分析了该转录因子在病害胁迫生理过程中的调控作用。具体研究结果如下：1.组织表达谱及进化分析提取毛果杨根、茎、叶等不同组织RNA,反转录成cDNA,通过荧光定量PCR检测毛果杨不同组织PtWRKY89表达水平。检索其他植物当中功能已知的WRKY转录因子,采用Mega4.0软件分析PtWRKY89与其他WRKY蛋白氨基酸序列的亲缘关系,并通过邻近法构建进化树。使用DNAman软件分析PtWRKY89与其他物种同源WRKY氨基酸序列的相似性。预测PtWRKY89的生物学功能。2. PtWRKY89受到水杨酸诱导表达采用水杨酸,茉莉酸,乙烯和黑斑病以及机械损伤,冷胁迫,盐胁迫处理野生型毛果杨,提取总RNA反转录(?)DNA,定量分析PtWRKY89转录水平,结果显示该基因只对水杨酸敏感。采用水杨酸处理野生型杨树,分别于处理后2h,5h,8h,24h收集叶片提取总RNA反转录cDNA,半定量分析PtWRKY89转录水平,结果显示SA处理后24小时内PtWRKY89表达量呈抛物线性趋势,于5-8h达到最大值,24h开始下降。3.亚细胞定位表明PtWRKY89为核定位蛋白构建亚细胞定位载体35S:GFP和35S:GFP:PtWRKY89转化洋葱表皮细胞,暗培养12h后于荧光显微镜下观察。结果显示,结果显示,对照组35S:GFP均匀定位于整个洋葱表皮细胞,非特异性定位；而35S:GFP:PtWRKY89特异性地定位于洋葱表皮细胞核。表明PtWRKY89转录因子系核定位蛋白。4.PtWRKY89基因的克隆及植物表达载体构建参照美国能源部(www.phytozome.com)提供的PtWRKY89基因序列,设计其全长引物。提取毛果杨RNA,反转录成cDNA,以此为模板扩增PtWRKY89,获得长度为1108bp的片段,回收扩增产物,与PCXSN载体相连接,转化大肠杆菌DH5a,在卡那霉素抗性的LB培养基中筛选阳性单菌落,酶切验证插入方向,进一步测序验证,获得该基因的过量表达载体。最终通过冻融法将植物表达载体转入农杆菌GV3101。5.根癌农杆菌介导的毛白杨遗传转化及分子验证以毛白杨的叶片作为转基因受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化来自于毛果杨的转录因子基因PtWRKY89。经潮霉素筛选培养后获得毛白杨抗性植株。经PCR验证共获得10个PtWRKY89株系,检测结果均呈阳性,初步证明外源基因PtWRKY89已整合到毛白杨基因组中,半定量PCR分析证明PtWRKY89在正义转基因植株当中表达量大幅增加。6.转PtWRKY89毛白杨抗病性增强用黑斑病病原菌(Marssonina brunnea)侵染野生型和转PtWRKY89毛白杨叶片,结果显示黑斑病在野生型叶片上快速且大量增殖,而在转PtWRKY89毛白杨叶片增殖则明显减弱。因此,PtWRKY89能增强杨树对黑斑病胁迫的耐受能力。