苎麻花叶病毒的分子鉴定及序列克隆

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苎麻花叶病是苎麻上的严重病害,其病毒是苎麻花叶病毒。虽然国内有人研究了苎麻花叶病毒的生物学特性,但对于其病原,分类地位和基因组结构方面的研究很少。为了解决这些问题,我们进一步对其进行了分子鉴定,为后续的研究打下了基础。 本实验从湖南农业大学苎麻研究所种质圃引种具有典型苎麻花叶病症状的苎麻品种,移植到海南。采集具有典型症状的苎麻叶片,通过高速和超速离心结合的方法进行苎麻花叶病毒的提纯。对病毒提取液进行SDS-PAGE电泳分析,在胶上有一相对分子量大约为33kDa的蛋白条带,此条带对照里没有,推测其为苎麻花叶病毒的外壳蛋白;对病毒的提取液用蛋白酶K消化法同时提取病毒和对照核酸,电泳检测到一对照没有的条带,同时对用进行分光光度计测病毒核酸的含量,结果显示其核酸主要有ssDNA组成。 为进一步研究病毒的基因组结构,利用双生病毒的简并引物PA和PB及另一对通用引物Fr11和Fr12以提取的病毒核酸为模板,进行扩增。分别扩出大约500bp和1200bp的片段,转化并测序。再根据测出的序列设计引物Fa1,Fa2和Ffbaf,Flbar,扩增2500bp和2700bp全长。将回收的2500bp和2700bp片段转化,筛选出重组质粒Fa-6和Ffba-8,测序。测序结果显示,Fa-6为begomovirusesDNA-A组分,其全长为2738bp;Ffba-8为begomovirusesDNA-A组分,其全长为2708bp。对病毒的基因组结构进行的研究表明,其DNA-A基因组结构具有典型的菜豆金色花叶病毒的特点,共编码6个开放阅读框(openreadingframes,ORFs),其中病毒链编码AV1和AV2两个ORFs,互补链编码ACI(Rep)、AC2,AC3和AC4四个ORFs;基因间隔区含有双生病毒所共有的茎环结构、保守的9核苷酸序列、TATA盒和三个不完全重复序列,这些结构都是双生病毒复制、转录起始和包装所必需的;基因组DNA-B编码2个ORFs,包括病毒链编码的BV1和互补链编码的BC1。病毒的BV10RF(866~1696)编码病毒的运动蛋白,互补链上的BClORF(1710~2585)编码核穿梭蛋白。而由相似性分析得知,组分DNA-A与中国番茄曲叶病毒福建分离株及台湾分离株的基因组组分DNA-A相似性最高,都为95%,与ToLCV-[China:Fujian:2005]的外壳蛋白相似性达到96%;组分DNA-B与与辣椒黄曲叶病毒的基因组DNA-B相似性最高,为76%。应用生物学软件MEGA3.0中的邻接法对全长核苷酸进行系统发育分析,其DNA-A组分与中国番茄曲叶病毒福建分离株亲缘关系最近:DNA-B组分与辣椒黄曲叶病毒亲缘关系最近。DNA-A组分与DNA-B组分的CR同源性达到86%。综上,我们初步认为苎麻花叶病毒为双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒,其基因组由两个组分组成,分别为DNA-A和DNA-B,并推测它为一种重组病毒,DNA-A组分的母本为番茄曲叶病毒福建分离株,DNA-B组分的亲本为辣椒黄曲叶病毒。
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