叶锈菌(Puccinia triticina)侵染引发的小麦(Triticum aestivum L.)叶锈病是一种常见的、广泛的小麦病害,流行年份给小麦生产造成严重损失。寄主抗病机制的研究是控制这类病害最经济、有效、可持续性和环保的方法。本课题组多年来从事小麦抵抗叶锈菌侵染的分子机制研究工作,小麦叶锈菌属于专化性非常强的活体寄生真菌,在不亲和组合中小麦通过过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)来抵抗叶锈菌的侵染,过敏性反应是指在叶锈菌侵染部位与吸器母细胞接触的寄主细胞快速死亡,从而限制病原菌的繁殖和扩展。为此,叶锈菌侵染诱发过敏性反应的信号转导机制一直是我们研究的重点。在前期工作的基础上,本文通过激发子-悬浮细胞和叶锈菌-小麦两个互作体系较为系统地探讨了钙离子和NO在寄主细胞表达过敏性反应中的作用,以及Ca2+、NO和H2O2三者之间的关系;利用转录组高通量测序技术对由钙信号介导的基因表达进行了分析。本文获得的主要结果如下:1、在激发子-悬浮细胞互作体系中,以感染叶锈菌的小麦叶片细胞间隙液IWF260作为激发子,刺激小麦品种‘洛夫林10’和‘郑州5389’的悬浮细胞,探讨由激发子引发悬浮细胞过敏性反应中Ca2+和NO的变化及相互作用。以荧光分子探针Fluo-3AM和DAF-FM DA分别对细胞内Ca2+和NO进行标记,利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对其动态变化进行实时监测,通过药物学试验对Ca2+产生的机制及其与NO的关系进行探讨。结果表明:两个小麦品种悬浮细胞的[Ca2+]cyt水平对激发子刺激的反应有着明显的差异,对叶锈菌小种260表现不亲和的‘洛夫林10’悬浮细胞在激发子刺激后330秒和700秒出现两个钙峰,而对该小种表现亲和的‘郑州5389’悬浮细胞在激发子刺激后[Ca2+]cyt水平稍有波动但变化不明显;药物学试验证明,[Ca2+]cyt的升高依赖于胞外钙离子内流,钙离子与激发子刺激诱发的过敏性防卫反应紧密相关。同样,在激发子刺激后,‘洛夫林10’悬浮细胞出现一个NO峰,而‘郑州5389’悬浮细胞胞质NO变化不明显。药物学试验初步证明,NO的产生与胞外钙离子内流密切相关。由此推测在小麦悬浮细胞应答激发子刺激诱发的过敏性反应中,NO可能在钙的下游发挥作用。2、在叶锈菌-小麦互作体系中,以小麦品种‘洛夫林10’与叶锈菌生理小种165和260分别组成亲和与不亲和组合,利用特异荧光分子探针DAF-FM DA对细胞内的NO进行标记,并辅以激光扫描共聚焦显微镜对叶锈菌侵染引发的小麦防卫反应过程中NO的动态变化进行观察,通过酶活性的测定并借助药物学试验对NO的产生机制及该互作过程中NO与H2O2和钙信号之间的关系进行了探讨。结果表明,不亲和组合在接种后4h在菌侵染部位的气孔保卫细胞中有极微弱的绿色荧光出现,表明有很少的NO产生,随着接种时间的延长,在接种后12h邻近气孔的细胞中其NO荧光逐渐增强,NO的荧光面积也在不断扩大,在接种后24-72h绿色荧光主要集中在发生HR的细胞内;而亲和组合只在接种后4h在菌接触的气孔处可观察到少量绿色荧光,而其后各时间点没有观察到绿色荧光。酶活性的测定结果显示,不亲和组合较亲和组合表现出较高的NOS和NR活性,初步表明不亲和组合中NO的产生源于NOS和NR两条酶促反应途径。酶抑制剂试验结果显示,无论注射NOS抑制剂L-NAME还是注射NR的抑制剂Na2WO4,两种处理均减缓了HR的发生速度,说明NOS途径和NR途径同时参与了NO介导的HR发生过程。预注射NO清除剂c-PTIO后再接种,不亲和组合中NO的产生时间被推迟到接种后48h,同时,HR的发生速度被减慢。给叶片分别预注射NADPH氧化酶抑制剂咪唑和胞外钙离子螯合剂EGTA后再接种,发现两种药物均使不亲和组合中NO的产生推迟,同时HR的发生速度也被减慢。结合实验室前期工作,初步证明,在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的过敏性反应过程中NO在Ca2+和H2O2下游发挥作用,三者共同参与了该互作体系中HR发生的信号转导过程。3、根据前两项结果,发现在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的HR过程中,钙离子在信号转导通路的上游发挥重要作用。在此基础上利用转录组高通量测序技术对小麦和叶锈菌互作过程中Ca2+介导的基因表达进行了分析。试验选用小麦单基因系Tc Lr26为材料,Tc Lr26和‘洛夫林10’含有同一个抗叶锈基因Lr26。对Tc Lr26叶片预注射EGTA然后再接种叶锈菌,以未注药处理的叶片做对照,在接种后不同时间取叶片提取RNA进行转录组测序(RNA-seq)。根据RNA-seq测序的结果进行数据分析,包括De novo序列拼接、数据库及功能注释分析,差异基因表达分析等。通过contigs的重组获得了80975条unigenes,对这些unigenes进行数据库注释分析,包括COG、GO分析和KEGG通道分析,获得了相对于未注药的样品,在注射了钙离子螯合剂EGTA后差异表达显著的基因在互作早期共有4311条,其中1673条表达量上调,2638条表达量下调,在互作后期这些基因共有1416条,其中829条表达量上调,587条表达量下调,文中对这些上下调的基因进行了功能注释分析。同时,利用实时定量PCR(RT-q PCR)技术对我们感兴趣的10个基因在互作早、晚期的表达进行了分析,结果与转录组测序结果一致;通过对与NO和H2O2代谢相关基因的RT-q PCR分析,发现NOS、NR、NR-1、CAT-1和SOD1.1的表达都受到使用EGTA螯合胞外钙降低胞内钙离子浓度的影响,这也为前两章中经药物学试验得出的钙离子在H2O2和NO的上游发挥作用的推理提供了转录组水平的分子证据。综上所述,我们认为,在小麦与叶锈菌互作过程中,Ca2+、H2O2和NO作为重要的信号分子参与了叶锈菌侵染诱发的HR表达过程,且钙离子在信号链的上游发挥作用。钙离子介导了与小麦抵抗叶锈菌侵染有关的诸多重要生理过程。