螺环乙酰乙酸内酯类抗生素具有广泛的生物活性，其中包括抗感染、抗肿瘤、抗疟疾和抑制胆固醇合成等。氯丝菌素(Chlorothricin，CHL)是螺环乙酰乙酸内酯类家族抗生素最具有代表性的分子之一，产生于Streptomyces antibioticusDSM40725，具有抗革兰氏阳性菌和胆固醇抑制活性。其分子由4-羟乙酰乙酸内酯与一个环己烯环形成的螺环，通过羧酸酯和一个反式十氢萘环相连接，最终构成独特的大环内酯骨架。其大环内酯骨架核心结构的形成可能包含了生物催化的Diels-Alder环化，Baeyer-Villiger氧化等罕见的酶催化反应。而其骨架的后修饰过程可能包含了生物催化的碳氢键连续氧化，糖基修饰，芳基氯化，甲基化等酶催化反应。碳氢键活化是有机化学合成的热点，氯丝菌素骨架侧链C-28位甲基的碳氢键如何在生物体内连续氧化引起了我们极大的兴趣。　　本文拟通过对CHL生物合成相关基因的体内和体外实验研究，揭示生物体在温和条件下如何完成这一系列化学反应，同时阐明相关酶的催化功能和CHL生物合成机制。　　P450氧化酶是生化研究的重点对象，具有催化羟化、环氧化和异构化等等众多反应的能力。我们推测CHL的C-28位甲基的氧化反应是由P450氧化酶负责催化的。因此，将一个推测的P450氧化酶ChlE2重新表达，得到了可溶性蛋白，CO结合实验证实ChlE2为P450氧化酶。体外活性测试证实ChlE2能催化CHL骨架侧链C-28位甲基连续氧化为羧基。体外测活实验还证实ChlE2能将含两个糖基，一个糖基和不带糖基的底物的C-28位甲基氧化，表明ChlE2对底物糖基化有很好的容忍性。相关底物结合常数实验以及酶学动力学测试表明：不带糖基的底物8-1D2G为三者中ChlE2催化最适合底物。通过ChlE2催化底物8-1D2G的反应进程曲线，推测底物通过反复进入蛋白活性中心最终完成甲基连续氧化。ChlE2分别和两个黄素依赖蛋白ChlEI、ChlE3的共催化实验表明：ChlE2催化氧化时不需要这两个蛋白的辅助。综合相关的体内数据，进一步明确了CHL生物合成后修饰途径。　　对负责CHL前体的合成羧化酶基因chlJ和其伴侣基因chlI进行了体内研究。分别以单拷贝和多拷贝的方式分别将chlJ和chlIJ基因回补至chlJ基因敲除突变株，使得氯丝菌素恢复产生，证实了羧化酶ChlJ和氯丝菌素生物合成相关，同时表明其伴侣蛋白ChlI对CHL产量有一定影响。另外，通过对野生型菌株进行chlIJ单拷贝回补，大大提高了CHL的产量，表明通过羧化酶ChlJ基因表达从而增强前体供应的确能提高CHL的产量。　　我们将Tetrocarcin A(TCA)生物合成基因簇中，一个高度同源的黄素依赖的氧化酶基因tcaE1体内异源回补至chlE3基因缺失突变株，结果氯丝菌素恢复产生。由于TCA分子骨架不是大环内酯结构，同时结合前期的chlE3基因体内实验结果和生物信息学分析，我们推测黄素依赖的氧化酶ChlE3可能负责特殊三碳单元掺入后的一步脱水反应，为聚酮长链D-A反应形成5,6-螺环提供双键。为验证此推测，我们尝试利用底物模拟物，探索特殊三碳单元的延伸机制。　　糖基化和甲基化是螺环类抗生素生物合成途径中常见的后修饰反应，我们对糖基转移酶基因chlC7进行了同框敲除，对甲基转移酶基因chlB5进行了基因回补和表达实验。此外对两个调节基因chlF1和chlF2进行了体内回补实验。