目的：　　 氨基酸决定了蛋白质自身的结构和活性,通过对一些天然氨基酸的化学修饰,将独特的化学基团引入蛋白,对于蛋白功能及活性具有很大影响。血栓调节蛋白　　 (thrombomodulin,TM)对血栓性疾病的诊断和治疗有着重要意义,将化学性质活泼的叠氮基团引入TM,可以进一步的发挥其优势作用。本实验旨在以pET-28a(+)质粒为表达载体,构建含有重组质粒的E.coliB834(DE3)菌株,诱导表达叠氮基修饰的大鼠血栓调节蛋白,并对其进行纯化和活性测定。　　 方法：　　 1、蛋氨酸类似物2-氨基-4-叠氮丁酸(AHA)合成　　 首先以L-蛋氨酸为起始原料经硫甲基化、水解合成L-2-氨基-4-羟基丁酸,然后经溴代开环、成酯、叠氮化、水解四步反应得到目标产物。经纯化重结晶、干燥后,室温密封待用。　　 2、质粒的提取及转化　　 复苏菌株E.coliBL21(DE3),提取质粒,并测序鉴定其DNA序列,将测序正确的质粒转化E.coliB834(DE3)感受态细胞。　　 3、含有AHA的融合蛋白的诱导表达　　 将转化成功的B834(DE3)阳性菌落接于3mlLB液体培养基,37℃振摇过夜,1%接种到100mlM9-20液体培养基中,37℃振摇过夜,4000r/min,5min,弃上清,菌体加入30mlM9-AHA液体培养基悬浮,4000r/min,5min,弃上清,菌体再以50mlM9-AHA重悬,3h至A600为0.5,加IPTG至终浓度为0.5mmol/L。30℃诱导5h,分别于1h,2h,3h,4h,5h取样,用凝胶浓度为10%的SDS-PAGE检测,考马斯亮蓝R250染色,同时以含空载pET-28a(+)质粒的E.coliBL21(DE3)及空宿主菌作为对照。　　 4、融合蛋白的纯化　　 将融合蛋白样品超声破碎后离心取上清通过0.45μm微孔滤膜,以0.4ml/min流速过柱。用PBS冲洗10min,流速为1.0ml/min,再用含有10mmol/L的GSH洗脱液洗脱融合蛋白,流速为1.0ml/min,洗脱10min。收集洗脱液于离心管中,于凝胶浓度为10%的SDS-PAGE检测。　　 5、融合蛋白的活性测定　　 取30份新鲜的大鼠血浆,每份100μl,加入部分凝血活酶100μl,分别加入按100%、75%、50%、25%、0%稀释的融合蛋白溶液,37℃预热5min,然后加入CaCl2溶液100μl,加入的同时开始计时,记录血浆凝固时间,并以同样稀释度的标签蛋白溶液作为对照。重复3组上述操作。　　 结果：　　 1、AHA的合成　　 淡黄色粉末,收率:90.2%,[α]20D=+0.42(c0.8,CH3OH)。IR(KBr,cm-1):3310、2096、1591、1390、1100。1HNMR(300MHz,D20)6:3.41(t,2H,J=7.4Hz)、2.96(m,1H)、1.89(m,2H)。　　 光谱数据与结构相符。　　 2、质粒的提取及转化　　 质粒提取并转化后,涂布平板,有阳性白色菌落长出,质粒构建成功。　　 3、融合蛋白的表达及纯化　　 经SDS-PAGE分析,重组菌所在泳道有相对分子质量约为47000的融合蛋白表达,在温度为30℃条件下,IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导4h时,融合蛋白的诱导表达量最高。利用GSTrapFF蛋白纯化预装柱得到了纯净的融合蛋白溶液。　　 4、蛋白的活性测定　　 以稀释度为横坐标,以3组重组质粒和空载质粒,对应凝血时间的平均值为纵坐标构建坐标图。利用SPSS统计软件,重组质粒的凝血时间与稀释度经直线回归分析有统计相关性(r=0.955,p＜0.05),而空载质粒的凝血时间与稀释度无统计相关性(r=-0.680,p＞0.05)。克隆表达的TM融合蛋白是具有生物活性的。　　 结论：　　 合成了蛋氨酸类似物-2-氨基-4-叠氮丁酸(AHA),其结构经IR、NMR确证。成功构建了重组质粒pET-28a(+)/TM,表达菌株E.coliB834(DE3)可以大量地表达大鼠TM。融合蛋白具有生物学活性。