论文部分内容阅读
研究背景及目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类病因尚未十分明确的慢性肠道炎症疾病,临床上常见有克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和(溃疡性结肠炎ulcerative colitis,UC)。流行病学研究指出,IBD主要好发于北美洲和欧洲,以白种人居多。其中,欧洲UC和CD的患病率高达505/10万和322/10万,UC和CD发病率分别为24.3/10万和12.7/10万,而同一时段亚洲UC发病率仅为6.3/10万。近年来,IBD的发病率和患病率在全球不同种族和不同地域内呈逐年上升趋势,已有近500万患者饱受CD或者UC的困扰,并且已逐步上升为我国消化道系统常见病之一。由于IBD易反复发作,尚无有效的根治手段,而患者较多发病于青壮年时期或老年期,发病后严重影响患者社会交际、工作和生活质量,并可伴有肠穿孔、肠梗阻等并发症,晚期甚至有直结肠癌变可能,带给患者严重的身心和经济负担。因而,探寻IBD的发生发展机制并寻找有效的治疗靶点将有利于更好的理解、治疗IBD和改善IBD患者的生活质量。20世纪90年代,“IBD卫生学假说”被首次提出,其指出幼年成长于极度卫生环境中可能阻碍免疫系统的适当成熟,而致使儿童在成年后更容易患有IBD。临床和动物实验研究也发现,蠕虫感染可减低对IBD的易感性或者预防IBD的发生,如给予UC或CD患者有活性的猪鞭虫受精卵后,患者病情明显缓解。血吸虫(Schistosoma)是我国的一种常见寄生性蠕虫,具有自发性免疫调节的功能。文献报道,Schistosoma对Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎以及IBD等过敏性和自身免疫性疾病具有调节作用。预先给予Smansoni虫卵感染小鼠,可预防三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎。类似地,S.mansoni幼虫感染小鼠后,也可减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。由此看出,Schistosoma感染可能具有调控IBD发生发展的作用,然而其具体作用机制尚未十分清楚。本课题旨在探讨日本血吸虫(S.japonicum)感染对DSS诱导实验性结肠炎小鼠的影响及其可能的作用机制。方法1.随机分为四组:Con组(空白对照)、DSS组(3%DSS)、CER+DSS组(S.japonicum尾蚴感染+3%DSS)和CER 组(S.japonicum尾蚴感染)。S.japonicum尾蚴(20±2条)经皮肤接触感染小鼠,3%DSS诱导IBD小鼠模型,每日采集小鼠粪便后称重,记录粪便性状和小鼠体重,进行粪便隐血检测和疾病活动度评分(DAI)。取材后,行H&E染色,评估组织病理评分(HS)及炎性细胞浸润程度;免疫荧光染色法检测肠黏膜组织中炎性细胞浸润程度。2.通过CBA法和流式细胞仪检测血清中炎性细胞因子表达,Real-time PCR检测结肠组织中炎性细胞因子和转录因子表达;Western blot检测核因子κB(NF-κB)通路和内质网应激(ERS)通路相关蛋白的表达。3.通过免疫荧光法检测结肠组织中cleaved-caspase3(C-C3)阳性细胞数,TUNEL法检测结肠组织中细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白表达水平。结果1.取材后发现CER+DSS组和CER组小鼠肝脏表面可见淡黄色虫卵结节。相较于DSS组小鼠,给予S.japonicum尾蚴预处理的CER+DSS组小鼠体重减轻程度更小(p<0.0001)、结肠更长(p=0.004)、炎性细胞浸润程度更轻、疾病活动度评分(p=0.005)和结肠组织病理评分(p=0.004)也更小。与Con组小鼠相比,单纯给予S.japonicum尾蚴感染并未对小鼠的体重、结肠、炎性细胞浸润程度、疾病活动度评分和结肠组织病理评分等方面造成影响。2.CBA法、流式细胞仪检测发现CER+DSS组小鼠血清中IL-6、IL-10和IFNγ表达均明显低于DSS组小鼠(p<0.001)。而Con组和CER组小鼠间血清中炎性细胞因子表达无明显差异。Real-time PCR检测发现DSS组小鼠结肠组织中IL-6的表达显著高于CER+DSS组(p<0.001),同时IL-10和IFNy的表达也比CER+DSS组略高(分别为p<0.01,p<0.05)。Con组和CER组小鼠结肠组织中除IL-10(p<0.05)之外的其他炎性细胞因子和转录因子表达无明显差异。Western blot检测发现,与DSS组相比,CER+DSS组小鼠结肠组织中P-P65和P-IκBα蛋白表达量均明显减少,IRE1α、IRE1β、GRP78和CHOP蛋白表达量也明显降低,且P-P65、IRE1α和IRE1β差异均有统计学意义(分别为p<0.05、p<0.01和p<0.05)。而CER组与Con组小鼠结肠组织中NF-κB通路及ERS通路相关蛋白表达量均无明显统计学差异。3.免疫荧光法、TUNEL检测结肠组织细胞凋亡,结果显示:DSS组小鼠结肠组织中C-C3阳性细胞和TUNEL阳性细胞均明显多于CER+DSS组。Western blot检测凋亡相关蛋白表达,结果显示:CER+DSS组、DSS组和CER组小鼠结肠组织中Bcl-2蛋白表达量均明显少于Con组,并且CER+DSS组小鼠结肠组织中Bcl-2蛋白表达量多于DSS组(P<0.05)。CER+DSS组、DSS组和CER组小鼠结肠组织中Bax蛋白表达量均明显多于Con组,其中CER+DSS组小鼠结肠组织中Bax蛋白表达量少于DSS组,差异无统计学意义。结论S.japonicum尾蚴感染可减轻DSS诱导实验性结肠炎小鼠的炎症反应,减少结肠粘膜组织细胞凋亡。除了对Th1/Th2/Th17应答的调控作用外,S.japonicum尾蚴感染还可能通过下调NF-κB通路和ERS信号通路转导,进而影响DSS诱导实验性结肠炎小鼠的炎症反应和细胞凋亡程度,尤其是ERS信号通路在其中发挥重要作用。这一发现可能为临床IBD的治疗提供新的思路。