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目的研究5-(3-amino-4-methoxyphenyl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3H-1,2-dithiol-3-one (COH-2-3)对急性前髓白血病HL60细胞的作用及其作用机制。方法一、MTT法应用MTT方法检测COH-2-3和顺铂对HL60细胞的生长抑制作用。取对数生长期细胞,调整细胞浓度,以每孔1×103个细胞密度接种到96孔板,每孔加200μL细胞悬液。实验分组：药物处理组(药物浓度分别为0.01,0.03,0.1,0.3,1.0,3.0μ/mL);阴性对照组(只加培养细胞,不加药)；空白对照组(只加培养基),每个组设6个复孔。将96孔板放在370C含5%C02的孵箱中培养44小时后,每个孔内加入20gL的3-(4,5-dimethylthythiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)溶液继续孵育4小时后,吸出上清液每孔加150μL DMSO震荡10分钟后应用酶标仪测各孔吸光度(OD)值,本试验重复三次,按以下公式计算抑制率：抑制率=(1-给药组平均OD值／对照组平均OD值)x100%。二、流式细胞术通过流式细胞术碘化丙锭(PI)单染检测药物COH-2-3对HL60细胞周期分布及凋亡的影响。取对数生长期的细胞,以1×105个／mL的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组(0.1,0.3,1.0μg/mLCOH-2-3处理24小时；1μg/mLCOH-2-3处理6,12,24小时),阴性对照组(只加培养细胞,不加药)。收集细胞,用PBS洗两遍,加入70%终浓度的酒精4℃固定过夜,20μg/mL的RNase37℃水浴箱中孵育30分钟后,加入终浓度为50μg/mL的PI溶液4℃避光孵育30分钟,流式细胞仪检测细胞各周期百分率和凋亡细胞百分率。三、吖啶橙(AO)／溴乙锭(EB)双染色法通过吖啶橙(AO)／溴乙锭(EB)双染色法观察凋亡细胞的形态学改变。取对数生长期细胞,以1×105个／mL的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组(1μg/mLCOH-2-3处理6,12,24小时),阴性对照组(只加培养细胞,不加药)。收集细胞,调整细胞浓度至1×106个／mL,取100μg/mL的AO/EB混合液1μL加到25μL的细胞悬液中吹打混匀,取一滴加到载玻片上盖上盖玻片,免疫荧光显微镜下观察细胞形态学改变。四、免疫荧光通过免疫荧光技术观察药物处理组细胞的微管蛋白形态学变化。取对数生长期细胞,以1×105个／mL的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组(1μg/mLCOH-2-3处理24小时),阴性对照组(只加培养细胞,不加药)。4%多聚甲醛固定10分钟,0.5%TritonX-100打孔30分钟,5%牛血清白蛋白37℃水浴箱中封闭2小时,1：50鼠抗β-tubulin单克隆抗体4℃孵育过夜,1：50抗鼠LgG抗体室温避光孵育2小时,1：100的Hoechst 33342染核10分钟,50%甘油封片,荧光显微镜下观察细胞微管形态变化。五、蛋白免疫印记(Western blot)法通过Western blot方法检测药物处理后细胞内的蛋白表达情况。取对数生长期细胞,以1×105个／mL的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组(cyclin B, P34cdc2, caspase-3:0.1,0.3,1μg/mL COH-2-3处理24小时；Bcl-2:1μg/mL COH-2-3处理24小时),阴性对照组(只加培养细胞,不加药)。收集细胞,测蛋白浓度,蛋白定量,加样,跑胶,转印,封闭后,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育2小时后ECL发光。以β-actin为内对照,用凝胶成像分析系统测定各条带灰度值,并取其与β-actin的比值为相对表达量分析蛋白的表达情况。结果通过MTT检测方法我们可以看出,COH-2-3与顺铂都能够明显的抑制HL60细胞生长,但COH-2-3对细胞的抑制作用强于顺铂(IC50分别为：0.026±0.004、0.963±0.012),两者相比差异有统计学意义,P<0.05；流式细胞术碘化丙啶PI单染结果表明,随着药物剂量的增加和药物作用时间的延长,G2／M期细胞所占比率和凋亡细胞所占比率逐渐增加,较阴性对照组相比差异有统计学意义,P<0.05;AO/EB双染色法观察到了凋亡细胞的形态学演变过程,从细胞核浓缩,核裂解到凋亡小体的形成；免疫荧光显微镜下观察到COH-2-3可抑制微管蛋白的聚合作用；Western blot结果表明COH-2-3使细胞内周期相关蛋白cyclin B表达明显增强,较阴性对照组相比差异有统计学意义,P<0.05；且使凋亡相关蛋白caspase-3被活化和抗凋亡蛋白Bcl-2下调,较阴性对照组相比差异有统计学意义,P<0.05。结论本研究结果表明,COH-2-3是通过阻滞HL60细胞在G2／M期并且诱导细胞凋亡来实现其抑制HL60细胞增值的作用。COH-2-3诱导的细胞周期阻滞与上调G2／M期相关调节蛋白cyclin B的表达和抑制微管蛋白的聚合作用有关；COH-2-3诱导的HL60细胞凋亡与抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调和凋亡蛋白caspase-3的激活有关。