脑胶质瘤是常见的中枢神经系统的恶性肿瘤,其恶性程度高、患者生存期短、易复发。胶质瘤最多发的区域是大脑,占大脑和中枢神经系统肿瘤的30%以及大脑恶性肿瘤的80%。也已表明,脑胶质瘤的恶性生物学特征与一群具有增殖、自我更新和分化能力干细胞样肿瘤细胞相关,胶质瘤干样细胞在肿瘤发生发展、转移复发以及对放疗、化疗的耐受作用中均起着重要的作用。B7-H6是B7共刺激分子家族的新成员,是NK细胞激活受体NKp30的配体,能够激活NK细胞的杀伤活性。B7-H6在多种肿瘤细胞中存在表达而在健康成人组织中却不表达。目前研究表明B7-H6能够在体外激活NK细胞的活性增强其对靶细胞的杀伤能力,并且有一部分研究报道了B7-H6能够抑制NK细胞活性。鉴此B7-H6分子在肿瘤细胞中表达的确切意义及其具体发挥作用的机制仍有待进一步探讨。本课题首先采用亚克隆的方法从人脑胶质瘤细胞株U87中分离得到胶质瘤干样细胞,并检测了B7家族分子的表达水平。发现相比U87细胞株,U87来源的肿瘤干样细胞中B7-H6不论在基因还是蛋白水平均显著上调表达。在此基础上,使用siRNA下调B7-H6的表达,进一步研究了其对细胞增殖能力以及对NK细胞杀伤能力的影响。进而,分析了B7-H6分子在临床标本中的表达以及其临床意义。本研究发现了B7-H6分子在脑胶质瘤特别是胶质瘤干样细胞中异常表达及其意义,并对其可能的作用机制进行初步探讨。第一部分人脑胶质瘤干样细胞的获取及鉴定【目的】:从人脑胶质瘤细胞株U87中分离并鉴定脑胶质瘤干样细胞。【方法】:使用亚克隆的方法并利用脑胶质瘤干样细胞在体外形成神经细胞球的特性,从U87细胞株中筛选得到脑胶质瘤干样细胞;利用RT-PCR和流式检测干性分子(Sox2、CD133、Nestin、CXCR4)的表达;通过CCK-8检测化疗药物杀伤作用鉴定其是否具有耐药特性。【结果】:(1)使用亚克隆方法分离获得的脑胶质瘤干样细胞并能在体外形成神经细胞球;(2)肿瘤干样细胞在mrna或蛋白水平上上调表达多种干细胞相关基因(sox2、cd133、nestin、cxcr4);(3)肿瘤干样细胞与初始u87细胞株相比具有对化疗药物显著的耐受性。【结论】:成功从u87细胞株中分离并鉴定得到脑胶质瘤干样细胞。第二部分b7-h6在u87来源的脑胶质瘤干样细胞中上调表达并与细胞增殖和nk细胞杀伤相关【目的】:分析b7家族分子在胶质瘤干样细胞上的表达,并探讨显著上调表达的b7-h6分子在胶质瘤干样细胞上表达的意义。【方法】:通过rt-pcr及流式分析获得的脑胶质瘤干细胞b7家族的表达;采用sirna干扰下调b7-h6表达,并采用cck-8检测细胞的增殖变化和化疗药物杀伤作用;采用cfse、pi双标流式检测sirna干扰后肿瘤干样细胞和nk细胞共培养时被杀伤的情况。【结果】:(1)b7家族分子b7-h1、b7-h3、b7-h4和b7-h6在得到脑胶质瘤干样细胞中均表达,与起始u87细胞相比,b7-h4呈现胞浆上调性表达而仅b7-h6显著的上调表达;(2)使用sirna干扰b7-h6表达后,胶质瘤干样细胞的增殖能力受到抑制,并且c-myc基因的表达也发生下调,但是对胶质瘤干样细胞的耐药性没有显著影响;(3)使用sirna干扰b7-h6表达后,nk细胞对b7-h6下调后的胶质瘤干样细胞的杀伤作用有所增强。【结论】:u87来源的胶质瘤干样细胞异常上调表达b7-h6,干扰实验证明,b7-h6具有促进对肿瘤干样细胞的增殖并抑制nk细胞的杀伤作用。第三部分b7-h6在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义【目的】:探讨b7-h6分子在脑胶质瘤临床中的表达及意义。【方法】:采用流式细胞术检测6中不同脑胶质瘤细胞株中b7-h6和cxcr4的表达;采用免疫组化检测石蜡切片中b7-h6蛋白的表达及定位;采用rt-pcr检测脑胶质瘤样本中b7-h6mrna水平的表达并分析与病例分级的关系。【结果】:(1)6株脑胶质瘤细胞株中5株不表达膜型b7-h6,只在细胞株uw28中检测到了b7-h6的表达,cxcr4的表达与b7-h6基本一致。(2)常规石蜡切片免疫组化结果分析显示,正常脑组织不表达B7-H6蛋白,而在脑胶质瘤组织中B7-H6蛋白的表达呈现胞膜和胞浆表达的不同定位;(3)在76例临床样本中,B7-H6mRNA的表达水平在IV级样本中显著升高,与低级别相比存在显著性差异(p<0.05)。【结论】:B7-H6在脑胶质瘤中的表达存在一定的临床意义。